猪链球菌LPxTG蛋白HP0197与外源蛋白的融合表达及融合蛋白抗原活性的检测

为了从蛋白水平探究猪链球菌(S.suis)的表面LPxTG(Leu-Pro-x-Thr-Gly,x表示任何氨基酸)蛋白HP0197在S.suis表面展示外源抗原的可行性,本研究分别经PCR扩增HP0197蛋白的功能区编码基因片段hp0197(去除了 HP1097全长蛋白aa1～aa40的转运信号肽序列和aa524～aa56的CWA基序)、hp0197-18 ku基因片段(即HP0197蛋白的18 ku结构域的编码基因)、hip0197-Loop基因片段(HP0197蛋白aa201～aa523的编码基因片段),并通过融合PCR将gfp基因融合至上述两段基因即HP0197蛋白的18 ku结构域和Loop区编码基因之间,并构建表达HP-GFP融合蛋白的重组质粒及表达HP0197蛋白的重组质粒,经测序鉴定后将其分别转化大肠杆菌BL21(DE3),并经IPTG诱导后采用SDS-PAGE鉴定.采用Ni-NTA亲和树脂方法纯化HP0197蛋白和HP-GFP融合蛋白后分别免疫小鼠,经间接ELISA检测首免后不同时间各组小鼠血清中的HP0197抗体和GFP抗体水平,评价HP-GFP 融合蛋白和HP0197蛋白的抗原活性.SDS-PAGE结果显示,分别经原核系统表达并纯化了 HP-GFP融合蛋白和HP0197蛋白.间接ELISA结果显示,单独免疫HP0197蛋白的小鼠产生了 HP0197抗体,但未产生GFP抗体;而免疫HP-GFP融合蛋白的小鼠,既产生了 HP0197抗体,也产生了 GFP抗体,且在首免后28 d这两种抗体效价均达1∶204 800.上述结果表明在HP0197蛋白的18 ku结构域和Loop区之间插入外源蛋白,可在保留HP0197蛋白自身抗原活性的前提下,有效发挥外源蛋白的抗原活性.本研究首次在蛋白水平上证实了 S.suis的LPxTG蛋白HP0197作为载体蛋白用于在S.suis表面展示外源蛋白的可行性,为进一步构建S.suis表面蛋白展示系统奠定了基础.