肠炎沙门氏菌FliC单克隆抗体阻断ELISA检测方法的建立及初步应用

为建立肠炎沙门氏菌(SE)血清学检测方法,本研究原核表达了 SE的FliC蛋白高变区,经SDS-PAGE和western blot鉴定分析,结果显示,原核表达的His-FliC和GST-FliC重组蛋白分别约为52 ku和70 ku,能够与SE阳性鸭血清特异性反应.GST-FliC重组蛋白经纯化后免疫BALB/c小鼠(150 μg/只),经细胞融合、克隆和筛选获得1株阳性杂交瘤细胞,命名为1D3.Western blot结果显示MAb 1D3可以特异性识别g,m型沙门氏菌鞭毛.以MAb 1D3为阻断抗体建立阻断ELISA(bELISA)方法,经条件优化后确定His-FliC重组蛋白包被浓度为4 μg/mL,MAb 1D3稀释倍数为1∶16 000,包被条件为4℃12h,封闭液为5％脱脂乳;利用该方法检测239份阴性鸭血清计算阻断率为30.46％(cut-off值).采用该bELISA方法检测SE、鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、阿培依姆沙门氏菌、大肠杆菌、阿尼蒂斯葡萄球菌、鸭疫里默氏杆菌的阳性血清,结果显示,除SE阳性血清外,该方法与其余病原阳性血清均不发生交叉反应,特异性强;利用本研究建立的bELISA方法与IDEXX试剂盒检测不同稀释倍数的SE阳性血清,结果显示,两种方法最低检测稀释倍数均能够达到1∶320,敏感性较高;重复性试验结果显示,bELISA方法的批内和批间变异系数均小于10％,重复性好.利用本实验建立的bELISA与IDEXX公司试剂盒对105份鸡血清样品和3个鸭场的48份鸭血清样品检测,结果显示,与IDEXX试剂盒比较,本实验建立的bELISA方法特异性为98.97％、敏感性91.07％,二者符合率为96.30％.利用本实验建立的bELISA方法和微量试管凝集试验(MAT)分别检测人工感染北京鸭血清抗体,两种方法结果均显示107cfu/只和106cfu/只SE感染7日龄的北京雏鸭后4 d～6 d产生抗体应答,两周后抗体效价达到峰值;109cfu/只感染14周龄北京鸭,感染后5 d抗体阳性率达到80％,感染后11 d平均抗体效价达到1∶120.本研究首次利用SE FliC蛋白制备MAb建立了阻断ELISA方法,该方法具有特异性好、敏感性高、特异性强的特点,能够快速有效检测SE感染的禽血清抗体,为禽SE的流行病学调查提供技术手段.