猪圆环病毒3型SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立针对猪圆环病毒3 型(porcine circovirus type 3,PCV3)的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法,使用DNAStar软件对GenBank中PCV3的ORF1基因进行保守区域分析,并使用Primer Premier 5软件对PCV3 ORF1基因的高度保守区域设计引物,经PCR扩增后构建了 PCV3 ORF1基因的标准品质粒,以构建的标准品质粒为模板,分别从退火温度优化、标准曲线和熔解曲线的建立、特异性、灵敏性、重复性等方面对所建立的检测方法进行探究.特异性试验结果显示,建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR特异性良好,仅对PCV3存在特异性扩增,而对其他8种病毒均无扩增;灵敏度试验表明该方法最低检测量为6.55拷贝/μL,是常规PCR的100倍;以浓度为6.55×102～6.55×108拷贝/μL的标准品质粒构建的标准曲线相关系数为0.996,扩增效率可达99.7％;重复性试验结果显示,组内变异系数和组间变异系数均在2％以内.临床试验对100份猪血清进行PCV3检测,结果显示建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的阳性率为16％(16/100),高于常规PCR的阳性率10％(10/100).结果表明,建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR可为PCV3的快速诊断、流行病学调查及防控提供技术支持.