免疫抑制受体IGSF9单克隆抗体的制备以及功能验证

目的 研发靶向免疫球蛋白超家族成员9(IGSF9)的特异阻断型单克隆抗体,并验证该抗体的功能.方法 将带有His标签的IGSF9细胞外结构域(IGSF9 extracellular domain,IGSF9-ECD)克隆到pcDNA3.1(-)的表达载体上,转染HEK293细胞,亲和层析获得IGSF9-ECD-His蛋白,应用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting进行蛋白鉴定.应用IGSF9-ECD-His蛋白免疫6周龄BALB/c小鼠4次,ELISA和流式细胞仪检测小鼠抗血清效价.分离小鼠脾脏细胞,与小鼠多发性骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,ELISA和流式细胞仪筛选阳性克隆,并进一步筛选亚克隆细胞,制备靶向IGSF9的单克隆抗体.将IGSF9抗体加入到T细胞和THP-1细胞共培养体系中,检测上清中IFN-γ和TNF-α水平.结果 IGSF9-ECD-His蛋白条带单一,分子量与预期相一致.在T细胞培养体系中加入该蛋白,显著抑制T细胞增殖.IGSF9-ECD-His蛋白免疫小鼠后,小鼠抗血清效价为1:364500,而且抗血清能够显著逆转THP-1对T细胞的增殖抑制.本研究获取了64株克隆阳性细胞株,其中有6株能够用于流式细胞仪检测.本研究选择了阻断效应最好的5 C3母克隆制备单克隆抗体,流式细胞仪和T细胞共培养结果筛选后,选择了阻断效应最好的5 C3-1 A4作为IGSF9单克隆抗体(anti-IGSF9),该抗体能够显著逆转IGSF9对T细胞的增殖抑制,并促进IFN-γ和TNF-α的分泌.结论 本研究成功制备了IGSF9单克隆抗体,而且该抗体能够显著逆转IGSF9对T细胞增殖抑制.