新型冠状病毒核蛋白抗原含量ELISA检测方法的建立及验证

目的 制备抗重症急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)多克隆抗体和抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N蛋白)单克隆抗体,建立针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,并对该方法进行验证.方法 将SARS-CoV-2灭活病毒纯化抗原免疫日本大耳白兔制备兔多克隆抗体;免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞株,经蚀斑减少中和试验(plaque reduction neutralization test,PRNT)和间接ELISA法筛选获得抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体.采用过碘酸钠氧化法对单克隆抗体5E11进行标记,偶联HRP分子,用方阵滴定法对包被抗体(50～800 ng/孔)和酶标抗体(1 ∶500～1 ∶8 000)的工作浓度进行优化,建立SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,确定方法线性范围和最低检测限,并对其准确度、精密度、耐用性、特异性进行验证.用建立的方法检测3批SARS-CoV-2灭活疫苗工艺过程阶段样品中N蛋白抗原含量.结果 选择高效价的SARS-CoV-2兔抗血清纯化后的多克隆抗体作为包被抗体,特异性强的单克隆抗体5E11作为酶标抗体,包被抗体最佳工作浓度为100 ng/孔,酶标抗体最佳工作浓度为1 ∶1 000,建立了针对SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法.该方法在1.6～200 WU/mL范围内,抗原含量与对应的A450/A630呈良好的线性关系,R2＞0.99,最低检出限为1.6 WU/mL;高、中、低(100、50、25 WU/mL)浓度SARS-CoV-2内部参考品检测均值回收率分别为104.33％、101.33％和98.67％,CV 分别为7.06％、7.47％和12.39％;重复性验证CV为8.54％,中间精密度验证CV为8.37％;耐用性验证回收率在88％～112％之间;该方法可特异性识别SARS-CoV-2全病毒Virion、重组N蛋白,与其他抗原均无交叉反应.结论 成功建立了 SARS-CoV-2 N蛋白抗原含量ELISA检测方法,该方法具有良好的线性相关性,准确度、精密度、特异性良好,可用于SARS-CoV-2灭活疫苗中N蛋白抗原含量的检测.