SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域的可溶性表达及功能鉴定

目的 可溶性表达严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)刺突蛋白受体结合域(recepter binding domain,RBD),并对其进行功能鉴定.方法 利用生物信息软件对SARS-CoV-2刺突蛋白RBD区DNA序列中的稀有密码子进行替换优化.人工合成优化的RBD DNA全序列,插入pGEX 6P-1原核表达载体,构建重组表达质粒pGEX 6P-1/RBD,转化大肠埃希菌Rosetta感受态细胞,IPTG诱导表达重组RBD蛋白,并进行亲和层析纯化.采用SDS-PAGE、Western blot、Pull-down试验鉴定重组RBD蛋白,并应用其检测康复期患者的血清中和抗体.结果 优化后RBD基因序列在大肠埃希菌中的表达难易值(CAI)由0.215提高至1.0;重组表达质粒pGEX 6P-1/RBD经菌落PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;获得的重组RBD蛋白为相对分子质量约60 000的可溶性蛋白,纯度约为82％,能与血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)发生特异性结合,并能测定康复期患者血清中的特异性抗体,且灵敏度较好.结论 成功获得了可溶性的重组RBD蛋白,该重组蛋白具备与人ACE2受体结合的功能,可用于中和抗体测定和疫苗接种后的效果评估.