PKR基因表达高效阻断Marc-145细胞系建立及其对PRRSV增殖的影响

研究猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)在Marc-145细胞蛋白激酶 R(interferon-induced,double-stranded RNA-activated kinase,PKR)下调表达状态下的感染特性.以 Macr-145 细胞PKR基因序列设计3个shRNA,并设阳性对照,合成后插入pSilencerTM 2.1-U6载体构建重组质粒,与Macr-145细胞PKR+EGFP标签融合表达的重组质粒共转染HEK293细胞,以筛选能下调表达PKR的shRNA,并将该shR-NA重组质粒转染Marc-145细胞,潮霉素B抗性筛选并克隆纯化获得PKR下调表达的细胞系,感染重组病毒PRRSV XZ06a-EGFP,通过检测病毒结构蛋白M与EGFP表达、观察细胞病变等,研究此状态下感染特性.结果显示筛选获得致使PKR下调表达的shRNA,以及稳定表达shRNA、PKR表达降低90％以上的Marc-145细胞系,重组病毒感染后48 h,M蛋白与EGFP表达均受到抑制,且与对照相比,感染后72～96 h,未观察到典型的细胞病变效应,说明在PKR表达受到抑制时,病毒增殖受到明显抑制.本研究通过建立PKR下调表达细胞系与PRRSV感染试验,初步阐明PKR在PRRSV增殖时所发挥的作用,为进一步开展PRRSV与细胞抗病毒固有免疫互作机制研究奠定了基础.