葡萄糖调节蛋白78对肝癌预后及肿瘤细胞增殖的影响

目的:分析葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78，GRP78）对肝癌预后及肿瘤细胞增殖的影响。方法:采用实验研究方法和回顾性队列研究方法。采用肝癌组织芯片，体外培养Huh7、Hep3B肝癌细胞和LO2正常肝细胞，结合免疫组织化学染色、细胞转染、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）、Western blot检测、细胞增殖实验、细胞克隆形成实验及高通量转录组学检测分析肝癌细胞GRP78表达情况。Hep3B、Huh7细胞转染GRP78基因特异性shRNA慢病毒设为GRP78-shRNA组，转染阴性对照shRNA慢病毒设为对照-shRNA组。观察指标：（1）肝癌组织和癌旁组织GRP78表达及其与临床病理特征的关系。（2）肝癌病人预后及影响因素分析。（3）抑制GRP78表达对肝癌细胞增殖的影响。（4）抑制GRP78表达对肝癌细胞p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6基因和蛋白表达的影响。（5）HA15对肝癌细胞增殖和p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6基因和蛋白表达的影响。正态分布的计量资料以 x±s表示，组间比较采用 t检验或方差分析。重复测量数据采用重复测量方差分析。计数资料以绝对数表示，组间比较采用 χ2检验。单因素和多因素分析采用COX比例风险回归模型。采用Kaplan-Meier法计算生存时间并绘制生存曲线，采用Log-rank检验进行生存分析。 结果:（1）肝癌组织和癌旁组织GRP78表达及其与临床病理特征的关系：肝癌组织芯片免疫组织化学染色结果显示，GRP78在90例肝癌组织中低表达53例，高表达37例，GRP78在90例癌旁组织中低表达84例，高表达6例，肝癌组织与癌旁组织比较，差异有统计学意义（ P<0.05）。（2）肝癌病人预后及影响因素分析：90例病人均获得随访，随访时间为5～56个月，中位随访时间为49个月。53例GRP78低表达肝癌病人中位总体生存时间和中位疾病无进展生存时间分别为56个月和53个月，37例GRP78高表达肝癌病人上述指标分别为32个月和19个月，两者比较，差异均有统计学意义（ χ2=17.482，12.097， P<0.05）。单因素分析结果显示：丙氨酸氨基转移酶（ALT）、肿瘤病理学分级、GRP78表达是影响肝癌病人3年总体生存率和疾病无进展生存率的相关因素（风险比=2.168，2.161，3.784和2.254，0.893，3.493，95%可信区间为1.061~4.432，1.069~4.368，1.793~7.989和1.096~4.636，0.438~1.818，1.631~7.252， P<0.05）。多因素分析结果显示：ALT>40 U/L、肿瘤病理学分级为Ⅲ~Ⅳ级、GRP78高表达是影响肝癌病人3年总体生存率和疾病无进展生存率的独立危险因素（风险比=2.317，2.039，3.740和2.194，2.177，2.927，95%可信区间为1.150~4.671，1.201~3.462，2.116~6.612和1.408~4.593，1.093~4.336，1.492~5.742， P<0.05）。（3）抑制GRP78表达对肝癌细胞增殖的影响：①qRT-PCR检测结果显示，GRP78 mRNA在Huh7、Hep3B、LO2细胞中的相对表达量分别为3.06±0.33、4.42±0.60、1.00±0.02，Huh7、Hep3B细胞分别与LO2细胞比较，差异均有统计学意义（ t=6.19，5.42， P<0.05）。②Western blot检测结果显示：GRP78蛋白在Huh7、Hep3B、LO2细胞中的相对表达量分别为1.65±0.01、1.77±0.01、0.99±0.02，Huh7、Hep3B细胞分别与LO2细胞比较，差异均有统计学意义（ t=75.09，108.10， P<0.05）。③细胞增殖实验检测结果显示：Huh7细胞GRP78-shRNA组和对照-shRNA组24、48、72、96 h细胞增殖率分别为111.51%±0.35%、144.85%±0.68%、188.71%±3.62%、282.51%±5.25%和190.08%±0.58%、285.76%±2.69%、459.51%±4.29%、597.88%±12.25%，两组比较，差异有统计学意义（ F组间=1 360.000， F时间=668.500， F交互=197.600， P<0.05）。Hep3B细胞GRP78-shRNA组和对照-shRNA组上述指标分别为124.47%±0.25%、153.25%±1.25%、195.45%±3.19%、282.51%±10.76%和179.69%±0.33%、322.67%±2.46%、486.27%±5.82%、622.35%±12.58%，两组比较，差异有统计学意义（ F组间=1 222.000， F时间=706.200， F交互=179.600， P<0.05）。④细胞克隆形成实验结果显示：Huh7细胞GRP78-shRNA组和对照-shRNA组细胞数分别为（125±3）个和（435±17）个，两组比较，差异有统计学意义（ t=17.86， P<0.05）；Hep3B细胞GRP78-shRNA组和对照-shRNA组上述指标分别为（138±3）个和（388±7）个，两组比较，差异有统计学意义（ t=32.29， P<0.05）。（4）抑制GRP78表达对肝癌细胞p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6基因和蛋白表达的影响：高通量转录组学检测结果显示，Huh7细胞GRP78-shRNA组相对于对照-shRNA组的p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6表达率分别为19%、334%、398%、41%、49%。①qRT-PCR检测结果显示：Huh7细胞GRP78-shRNA组和对照-shRNA组中，GRP78、p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA的相对表达量分别为0.17±0.03，4.05±0.71，3.73±0.47，0.49±0.09，0.48±0.06，0.36±0.07和1.00±0.05，1.03±0.17，1.00±0.07，1.01±0.09，1.02±0.14，1.00±0.03，两组比较，差异均有统计学意义（ t=14.62，4.17，5.72，4.26，3.49，8.82， P<0.05）。Hep3B细胞GRP78-shRNA组和对照-shRNA组上述指标分别为0.11±0.01，4.28±0.43，4.19±0.22，0.44±0.01，0.25±0.03，0.68±0.04和1.01±0.09，1.02±0.15，1.00±0.06，1.01±0.09，1.01±0.08，1.15±0.02，两组比较，差异均有统计学意义（ t=10.19，7.14，13.79，6.37，9.42，9.61， P<0.05）。②Western Blot检测结果显示：Huh7细胞GRP78-shRNA组和对照-shRNA组中，GRP78、p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6蛋白的相对表达量分别为0.45±0.01，1.98±0.05，2.31±0.12，0.75±0.03，0.69±0.04，0.82±0.03和1.01±0.05，1.03±0.01，1.00±0.02，1.00±0.01，1.01±0.02，1.00±0.03，两组比较，差异均有统计学意义（ t=11.07，14.56，11.30，11.29，10.55，11.37， P<0.05）。Hep3B细胞GRP78-shRNA组和对照-shRNA组上述指标分别为0.61±0.03，1.98±0.16，2.55±0.12，0.85±0.03，0.78±0.01，0.54±0.02和1.00±0.03，1.05±0.02，1.05±0.01，1.05±0.02，1.00±0.02，1.00±0.02，两组比较，差异均有统计学意义（ t=10.97，13.40，12.35，11.06，12.45，13.78， P<0.05）。（5）HA15 对肝癌细胞增殖和p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6基因和蛋白表达的影响：HA15半抑制浓度（IC50）实验结果显示，Huh7、Hep3B细胞48 h IC50分别为9.98 μmol/L、13.70 μmol/L。①分别以9.98 μmol/L和13.70 μmol/L HA15作用Huh7、Hep3B细胞，细胞增殖实验检测结果显示：HA15-Huh7细胞和正常Huh7细胞24、48、72、96 h细胞增殖率分别为112.81%±0.27%、154.71%±1.45%、237.66%±16.77%、294.40%±14.92%和133.67%±0.49%、352.93%±2.31%、557.17%±4.89%、662.60%±13.31%，两者比较，差异有统计学意义（ F组间=766.800， F时间=518.200， F交互=133.300， P<0.05）；HA15-Hep3B细胞和正常Hep3B细胞上述指标分别为121.27%±2.32%、203.85%±3.18%、240.80%±3.02%、286.50%±7.10%和239.14%±1.02%、362.00%±5.44%、539.37%±10.80%、694.79%±17.13%，两者比较，差异有统计学意义（ F组间=594.300， F时间=317.900， F交互=78.600， P<0.05）。②qRT-PCR检测结果显示：HA15-Huh7细胞和正常Huh7细胞中，GRP78、p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6 mRNA的相对表达量分别为0.27±0.05，3.64±0.28，4.13±0.41，0.51±0.07，0.39±0.03，0.17±0.02和1.02±0.14，1.00±0.03，1.00±0.05，1.01±0.08，1.01±0.09，1.03±0.17，两者比较，差异均有统计学意义（ t=5.00，9.25，7.63，4.73，6.82，5.01， P<0.05）；HA15-Hep3B细胞和正常Hep3B细胞上述指标分别为0.28±0.03，3.49±0.78，4.31±0.53，0.38±0.05，0.36±0.04，0.24±0.03和1.01±0.11，1.03±0.18，1.01±0.08，1.00±0.06，1.02±0.15，1.00±0.06，两者比较，差异均有统计学意义（ t=6.26，3.08，6.21，7.97，4.26，11.08， P<0.05）。③Western blot检测结果显示：HA15-Huh7细胞和正常Huh7细胞中，GRP78、p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6蛋白的相对表达量分别为0.52±0.05，1.94±0.08，1.58±0.02，0.89±0.00，0.86±0.02，0.74±0.01和1.02±0.03，1.00±0.03，1.02±0.02，1.04±0.03，1.00±0.01，1.01±0.02，两者比较，差异均有统计学意义（ t=11.54，10.28，11.03，12.81，13.67，10.09， P<0.05）。HA15-Hep3B细胞和正常Hep3B细胞上述指标分别为0.57±0.02，1.67±0.04，1.41±0.04，0.82±0.03，0.70±0.02，0.74±0.01和1.03±0.01，0.98±0.03，1.00±0.03，1.03±0.03，1.01±0.01，1.04±0.01，两者比较，差异均有统计学意义（ t=10.81，11.54，12.26，13.62，14.23，10.17， P<0.05）。 结论:GRP78高表达是影响肝癌病人3年总体生存率和疾病无进展生存率的独立危险因素，抑制GRP78表达可抑制肝癌细胞增殖活性及影响p53、p21、CDK2、CDK4、CDK6基因和蛋白表达。