牦牛源BVDV非结构蛋白NS5A的原核表达及抗原表位分析

[目的]利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能.[方法]参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A.经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达.经10％SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测.[结果]PCR扩增NS5A目的基因片段为1 488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功.经10％SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符.通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型.NS5A蛋白的亲水性主要位于12-21、32-69、75-113、120-135、143-147、152-163、165-180、215-230、265-274、296-340、348-378、389-447、455-463、469-495 位氨基酸处,表面可塑性主要位于 14-18、37-42、76-81、86-109、154-160、169-178、218-228、297-309、348-358、365-373、414-442、430-437、454-460 位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14-21、37-43、67-82、86-93、97-110、152-158、169-179、218-231、240-255、296-310、313-328、344-359、364-373、413-422和472-483位氨基酸处.NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15-18、76-81、154-158、169-178、218-228、297-309、348-358、365-373和414-422位氨基酸处.[结论]成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考.