基于逆转录-酶促重组等温扩增原理的西尼罗病毒基因检测方法的建立

目的 建立一种可用于检测西尼罗病毒特异性基因片段的逆转录-酶促重组等温扩增(RT-ERA)方法.方法 以西尼罗病毒NS5基因的高度保守序列作为靶序列,根据ERA反应原理设计、合成引物及荧光探针,建立荧光RT-ERA反应体系.分别以不同拷贝数(104、103、102、10、1拷贝/μl)的含120 bp靶基因片段的重组质粒及不同浓度(10、1、10-1、10-2、10-3ng/μl)西尼罗病毒RNA为模板进行荧光RT-ERA法扩增,评价该方法的敏感度;分别以森林脑炎病毒、基孔肯雅病毒、Ⅰ型登革病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒、黄热病毒和甲型流感病毒H2N1的RNA为模板进行荧光RT-ERA法检测,评价该方法的特异性.结果 建立的荧光RT-ERA法可在39℃、20 min内特异性扩增西尼罗病毒RNA.敏感度检测结果显示,以重组质粒为模板,荧光RT-ERA法最低可检出的质粒拷贝数为1拷贝/μl;以RNA为模板,荧光RT-ERA法最低可检测浓度为10-3ng/μl.特异性检测结果显示,以森林脑炎病毒、基孔肯雅病毒、登革病毒Ⅰ型、乙型脑炎病毒、黄热病毒和甲型流感病毒H2N1的RNA为模板,荧光RT-ERA法检测结果均为阴性,仅西尼罗病毒RNA扩增阳性.结论 成功建立了一种可用于检测西尼罗病毒RNA的荧光RT-ERA法,该方法操作简便,敏感度和特异性均较好.