华支睾吸虫高迁移率族蛋白1同源蛋白的表达及其对小鼠巨噬细胞核转录因子-κB活化作用

根据华支睾吸虫死亡细胞释放的高迁移率族蛋白1(CsHMGB1)同源分子编码序列构建pET-28a(+)表达质粒并转化至Rosetta(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导CsHMGB1-His融合蛋白表达;Ni-TED琼脂糖树脂纯化蛋白后,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析鉴定His标签融合蛋白表达情况.用含不同浓度(1 μg/ml和10 μg/ml)CsHMGB1-159/127的培养液与小鼠巨噬细胞RAW264.7共培养,同时设立无刺激物的空白对照组,培养24 h和48 h.用pNiFty2-SEAP质粒和HEK-BlueTM培养基检测SEAP活性代表核转录因子-κB(NF-κB)活化,用酶标仪检测培养上清吸光度(A620值),并在显微镜下观察细胞内蓝色显色反应.结果显示,分别表达出编码159和127个氨基酸的CsHMGB1-159/127蛋白,相对分子质量(Mr)约为23 500和20 000.1和10 μg/ml CsHMGB1-159蛋白刺激小鼠巨噬细胞24 h后的A620值分别为0.66±0.08和0.65±0.03,均高于对照组(0.29±0.02)(t=11.1,28.5,P＜0.01),且胞浆均出现明显蓝色;48h后的A620值分别达1.02±0.08 和 1.07±0.08,均高于对照组(0.62±0.035)(t=11.2、12.9,P＜0.01),且胞浆蓝色加深.用1和10 μg/ml CsHMGB1-127蛋白刺激24 h后的A620值分别为0.52±0.08和0.56±0.08,均高于对照组(t=7.39、8.37,P＜0.01),胞浆也出现明显蓝色;48 h后的A620值分别达到1.10±0.05和0.90±0.10,均高于对照组(t=20.30、6.26,P＜0.01),胞浆蓝色也明显加深.1和10 μg/ml CsHMGB1-159蛋白刺激24 h后的A620值高于相应浓度的CsHMGB1-127蛋白(t=2.98、2.75,P＜0.05);48 h后两种蛋白的A620值的差异有统计学意义(t=-2.07,P＜0.01;t=3.40,P＜0.05).CsHMGB1-159 比 CsHMGB1-127 蛋白在体外均能够刺激小鼠巨噬细胞NF-κB活化,CsHMGB1-159比CsHMGB1-127蛋白的作用更强.