盐胁迫条件下杜梨叶片差异表达基因qRT-PCR内参基因筛选

为了准确评价盐胁迫下杜梨(Pyrus betulaefolia Bunge.)目标基因表达量,筛选qRT-PCR适用内参基因.利用杜梨的全基因组注释信息和转录组测序数据,选择Actin2(Chr15.g01351)、EF1α-1(Chr3.g19898)、EF1α-2(Chr4.g38173)、EF2(Chr5.g06899)、GAPDH-1(Chr16.g30426)、GAPDH-2(Chr13.g23532)、TUBB(Chr5.g06472)、UBQ(Chr4.g40121)等 8 个候选基因,设计 Actin2、EF1α-1、EF1α-2A、EF1α-2B、EF2、GAPDH-1、GAPDH-2、TUBB-A、TUBB-B、UBQE 等 10 对 qRT-PCR 引物.首先对10对引物的扩增效率进行了测定,再以200 mmol·L-1的NaCl溶液对两个杜梨家系(盐城和连云港)幼苗进行0、24、48、72 h盐胁迫处理.提取叶片的总RNA,反转录合成cDNA,使用10对引物进行qRT-PCR扩增,根据扩增产物使用delta Ct、BestKeeper、geNorm和NormFinder等4种评价内参基因稳定性的方法,对10对引物扩增产物的稳定性进行分析,并使用RefFinder软件对4种评价方法进行综合分析,以确定最稳定内参基因及其引物.利用筛选出的2对最优内参基因引物对(TUBB-A和GAPDH-1)对1个可能参与杜梨盐胁迫响应的HKT基因(Chr16.g29024)的表达情况进行分析,8个候选内参基因的FPKM值(Fragments PerKilobase Million)都大于30,不同盐处理时间下的FPKM变异系数为0.087～0.260;10对荧光定量PCR引物的扩增效率在91.82％～112.99％之间,其中引物对TUBB-A和GAPDH-1的扩增效率最接近于100％;稳定性分析显示10对引物扩增产物的稳定性排序为GAPDH-1、TUBB-A、EF1α-1、TUBB-B、EF1α-2 A、EF2、UBQE、GAPDH-2、Actin2、EF1α-2B;不同引物对(TUBB-A、TUBB-B 和EF1α-2A、EF1α-2B)对同一基因的扩增产物的稳定性存在明显差异;利用TUBB-A和GAPDH-1分析HKT基因的表达趋势没有差别.说明基因GAPDH和TUBB适于作为杜梨盐胁迫下进行荧光定量PCR的内参基因,对应的GAPDH-1、TUBB-A引物对的扩增效果最好.