蝴蝶兰PhPP2Aa基因作为低温胁迫内参基因的研究

实时荧光定量PCR(qPCR)技术因其具有简单灵敏、准确高效等诸多优点,成为目的基因表达水平研究最常用的技术手段.而结果的可靠性取决于很多因素,其中使用合适的内参基因是qPCR技术最基本的应用前提.许多研究表明没有一种内参基因可以在任何条件下都能稳定地表达.目前尚未见到关于蝴蝶兰低温生长条件下最佳内参基因选择的有关报道.蛋白磷酸酶2A(PP2A)是真核生物体内一种主要的细胞内源丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶.本研究根据蝴蝶兰低温转录组测序结果克隆得到1个PP2A的A亚基基因,其cDNA开放阅读框(ORF)长度为1764 bp,编码1个含有587个氨基酸的蛋白,将该基因命名为PhPP2Aa,GenBank登录号为MW847782.序列分析结果表明,该基因与其他植物PP2A核苷酸序列相似性均在80％以上,氨基酸序列与小兰屿蝴蝶兰PP2A序列相似性为99.66％.基于氨基酸序列进化分析结果表明,蝴蝶兰PhPP2Aa与小兰屿蝴蝶兰和铁皮石斛的亲缘关系最近.将蝴蝶兰PP2A与其他7种候选内参基因(TUA、TUB、ACTIN、F-box、RPL19、RPL36及RPL41)进行实时荧光定量PCR,用3种常用内参基因分析软件对各个基因Ct值进行稳定性分析,结果表明蝴蝶兰8个候选内参基因在低温胁迫条件下表达水平最稳定的内参基因为PP2A,其次为ACTIN;最不稳定的基因为F-box,其次为TUA.以蝴蝶兰PP2A作为内参基因探讨低温胁迫响应基因PhNAC1的表达情况,结果显示蝴蝶兰PhNAC1的表达模式符合低温胁迫条件下的表达特性.该结果表明蝴蝶兰PhPP2Aa基因可作为低温胁迫条件下目的基因转录水平研究的内参基因.