PCR反应条件对16S rRNA基因扩增子测序准确性的影响

[背景]16S rRNA基因扩增子测序技术是一种不依赖培养而获得样本中细菌种群结构、相对丰度等信息的方法.高通量测序技术实验步骤较多,每一步骤细微的差别都可能在最终的测序结果中放大,并造成测序结果与实际情况的偏差.[目的]基于MiSeq测序平台,探讨PCR反应体系中扩增引物序列、退火温度、模板起始量、扩增循环数和变性时间等5个因素对16S rRNA基因测序结果的影响.[方法]对mockDNA的16SrRNA基因扩增子进行测序,分别分析不同的扩增引物、退火温度、模板起始量、循环数和变性时间对数据准确性的影响.[结果]不同的扩增引物对检测结果有较大的影响,采用的4组引物中,引物B(V3-V4,341F/806R)的准确性最好,引物A(V3-V4,341F/805R)次之.比较不同退火温度(52、55和60℃)对检测准确性的影响,退火温度60℃的结果最接近理论值.模板起始量(2、10和50 ng)的检测结果显示,mock DNA起始量为2 ng的结果准确性最高.相较于其他3组(15+18、25+8和30+8),循环数为(20+8)的检测结果最接近mockDNA的理论值.不同变性时间(3 min和5 min)对分析结果无显著性影响.[结论]引物序列、退火温度、模板起始量和循环数是影响16S rRNA基因测序结果准确性的重要因素.