树突状细胞来源胞外体转运丁型肝炎抗原诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞反应的体外研究
Chinese Journal of Infectious Diseases(2022)
Abstract
目的:探讨携带泛素化修饰丁型肝炎抗原(hepatitis D antigen, HDAg)的树突状细胞来源的胞外体(dendritic cell derived exosomes,Dexs)在诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)反应中的作用及其分子机制。方法:提取并诱导C57BL/6小鼠髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)后与Ub-S-HDAg-Dexs共孵育48 h,流式细胞仪检测表面分子[CD86、CD80、主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅱ]的表达水平。提取C57BL/6小鼠脾源性T淋巴细胞与经胞外体刺激的DC共孵育后共培养72 h,分为Ub-S-HDAg-Dexs组(加入50 μg/mL Ub-S-HDAg-Dexs)、Blank-Dexs组(加入50 μg/mL无质粒转染的DC来源胞外体)、Con-Dexs组(加入50 μg/mL经空白慢病毒转染的DC来源胞外体)、PBS组[加入50 μL/mL磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)]、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组(加入50 μg/mL Ub-S-HDAg-Dexs,经胞外体刺激的DC与T淋巴细胞混合时同时加入50 μmol/L AG490),流式细胞术检测CD8与γ干扰素双阳性T细胞,非放射性乳酸脱氢酶检测试剂盒检测CTL细胞的杀伤活性。采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质印迹法分别检测T淋巴细胞中Jak激酶(Janus kinase, JAK)2、GATA结合蛋白3(GATA-binding protein 3,GATA3)、T-bet、信号转导及转录激活因子(signal transduction and activator of transcription,STAT)1、STAT4的mRNA和蛋白质表达水平。统计学分析采用独立样本 t检验。 结果:经Ub-S-HDAg-Dexs刺激,DC表面分子CD80、CD86、MHCⅡ阳性率为83.850%±0.219%、68.910%±0.134%、84.320%±0.445%。在Ub-S-HDAg-Dexs组,γ干扰素和CD8双阳性率为6.420%±0.028%, 高于PBS组、Blank-Dexs组、Con-Dexs组、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组( t=90.78、30.32、63.06、85.42,均 P<0.001);细胞杀伤率为82.4%±3.9%,高于PBS组、Blank-Dexs组、Con-Dexs组、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组( t=17.28、9.74、3.95、15.89,均 P<0.050)。Ub-S-HDAg-Dexs组JAK2、T-bet、STAT1、STAT4 mRNA相对表达量分别与Con-Dexs组( t=10.74、32.34、13.00、16.28,均 P<0.001)、Blank-Dexs组( t=15.05、21.51、6.46、13.12,均 P<0.050)、PBS组( t=21.83、41.42、7.30、17.50,均 P<0.050)、Ub-S-HDAg-Dexs+AG490组( t=35.75、20.69、17.02、17.07,均 P<0.001)相比,差异均有统计学意义。Ub-S-HDAg-Dexs组T-bet、STAT1、STAT4蛋白质表达水平高于PBS组,差异均有统计学意义( t=346.70、57.54、55.81,均 P<0.001)。Ub-S-HDAg-Dexs组加入AG490后,T-bet、STAT1、STAT4的蛋白质表达水平均较Ub-S-HDAg-Dexs组下降,差异均有统计学意义( t=355.40、52.79、126.10,均 P<0.001)。 结论:胞外体转运泛素化修饰的HDAg能有效促进DC成熟,诱导T淋巴细胞分化,产生特异性CTL反应,为丁型肝炎免疫治疗提供新的思路。
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Key words
Hepatitis D,Exosomes,Adaptive immunity,JAK-STAT pathway
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