家蚕丝腺中Abd-A 3种剪接体的克隆、序列分析及原核表达

为探究转录因子Abdominal-A(Abd-A)在家蚕丝腺中的剪接形式及其序列特征,明确与其他昆虫Abd-A的亲缘关系,以家蚕丝腺组织cDNA为模板,对转录因子Abd-A进行PCR扩增,利用生物信息学方法,对Abd-A的序列特征以及不同昆虫间Abd-A的进化关系进行分析;并通过原核表达系统对Abd-A进行体外重组表达,利用SDS-PAGE和Western blot检测其蛋白质表达水平.结果显示,从家蚕丝腺中克隆到Abd-A的3种剪接体,其编码区长度分别为1 059、1 044、1 032 bp,分别命名为BmAbd-A L(A59T)、BmAbd-A S、BmAbd-A 3.不同昆虫Abd-A的多序列比对结果表明,它们的氨基酸序列差异较大,但都具有DNA结合结构域Homeobox domain和转录激活结构域Abd-A domain,其中Homeobox domain序列完全保守,而Abd-A domain的羧基端序列存在较大差异.三维结构预测结果表明,Abd-A的3种剪接体编码蛋白质中均有4个α螺旋结构和无规则卷曲结构,其中无规则卷曲结构差异较大.系统发育分析结果表明,35种不同昆虫的Abd-A编码的氨基酸序列主要分为4个目,分别为双翅目、鳞翅目、鞘翅目、膜翅目,家蚕的Abd-A氨基酸序列与大蜡螟(鳞翅目:螟蛾科)在进化关系上更近,其次为玉米螟.SDS-PAGE 及 Western blot 分析表明,BmAbd-A L(A59T)、BmAbd-A S、BmAbd-A 3 的融合蛋白主要以可溶形式在大肠杆菌中表达,其理论分子质量分别为52.99、52.35、51.91 ku,与预期一致.综上,从家蚕丝腺中成功克隆到Abd-A的3种剪接体,它们的序列及三维结构间具有差异性,其分子进化过程与物种系统进化一致,并利用原核表达系统获得可溶性的Abd-A重组蛋白.