基于BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路探讨健骨颗粒氯仿萃取部位对体外成骨细胞分化的影响

目的:通过观察健骨颗粒氯仿萃取部位对体外培养成骨细胞的影响,研究其调控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix信号通路影响成骨细胞分化的可能机制.方法:选用年龄<3 d的BALB/c小鼠,从其颅盖骨提取原代成骨细胞,并采用碱性磷酸酶染色法对所提取的细胞进行鉴定;取生长状态良好的第3代成骨细胞作为实验对象,将健骨颗粒氯仿萃取部位稀释至不同的浓度梯度,即设置0、2、4、8、16、32、64 ng/mL 7个药物浓度组对细胞进行干预,采用MTT法筛选健骨颗粒氯仿萃取部位促进成骨细胞增殖的最佳浓度,作为最佳药物干预浓度进行后续实验.取第3代细胞,将其分为空白组、抑制剂组(BMP2抑制剂Noggin干预)、药物组(健骨颗粒氯仿萃取部位干预)和抑制剂加药物组(Noggin加健骨颗粒氯仿萃取部位干预),按组别干预后进行后续实验.采用RT-PCR检测各组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及成骨细胞分化相关基因ALP、CollagenⅠmRNA的表达水平;采用Western blot法检测各组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及ALP、Colla?genⅠ的蛋白表达,观察健骨颗粒氯仿萃取部位对成骨细胞分化的影响.结果:经碱性磷酸酶染色法鉴定,所提取的原代细胞阳性率高达90％为成骨细胞;采用MTT法检测发现健骨颗粒氯仿萃取部位在药物浓度为32 ng/mL时,成骨细胞增殖速度最快,在干预2 d时达到增殖高峰,故选用32 ng/mL干预2 d作为健骨颗粒氯仿萃取部位最佳干预浓度进行后续实验;RT-PCR与Western blot检测结果显示,与空白组相比,抑制剂组BMP2、Smad1、Runx2、Osterix及ALP、CollagenⅠ各指标基因表达水平显著降低,蛋白相对表达量明显降低(P<0.01或P<0.05);与空白组相比较,药物组6个指标基因表达水平显著升高,蛋白相对表达量也明显升高(P<0.01或P<0.05);抑制剂加药物组与抑制剂组比较,各指标基因表达水平和蛋白相对表达量均显著升高(P<0.01或P<0.05).结论:①使用Noggin抑制细胞内BMP2的表达后,Smad1、Runx2、Osterix的基因和蛋白的表达明显下降,与此同时成骨细胞分化相关指标ALP、CollagenⅠ基因和蛋白表达也明显下降,提示BMP2通路与成骨细胞分化密切相关.②健骨颗粒氯仿萃取部位干预原代成骨细胞后能够升高细胞内BMP2、Smad1、Runx2、Osterix与成骨细胞分化相关指标ALP、CollagenⅠ基因和蛋白的表达,促进成骨样细胞分化;提示健骨颗粒氯仿萃取部位可以通过调控BMP2/Smad1/Runx2/Osterix通路,促进成骨细胞分化,从而达到防治绝经后骨质疏松症的作用.