番木瓜果实酵母双杂交文库的构建及CpMYB114L互作蛋白的筛选

[目的]从番木瓜4个不同成熟期果实的转录组中筛选并克隆得到1个转录因子CpMYB114L,构建番木瓜果实的cDNA文库,筛选与CpMYB114L互作的蛋白,探究CpMYB114L参与调控果实成熟的分子机理.[方法]以番木瓜'GZBG,品种的果实为材料,设计特异引物,克隆CpMYB114L CDS区,利用生物信息学软件分析该基因序列及其编码的蛋白序列.提取番木瓜不同成熟期果实的总RNA,利用all-direct法建立酵母双杂交cDNA文库.构建pGBKT7-CpMYB114L诱饵载体,对其自激活检测后,通过共转化从文库中筛选CpMYB114L互作蛋白.通过在NCBI网站上进行序列比对,明确互作蛋白的功能分类,最后对各类蛋白基因在番木瓜不同成熟期果实中的表达进行分析.[结果]CpMYB114L基因的CDS序列编码227个氨基酸,预测其相对分子质量为26 304.3,理论等电点为6.23,亲水性总平均值为-0.893.CpMYB114L蛋白序列与甜樱桃(PaWERL)、蒺藜苜蓿(MtMYB1)、黛豆(MpMYB113)、大豆(GmMYB1)和苹果(MdMYB308L)的同源性较近.cDNA文库总库容为1.15×107 CFU,重组率100％,插入片段长度为750～2 000 bp.诱饵载体pGBKT7-CpMYB114L不存在自激活.从酵母双杂交文库中筛选到30个初始阳性克隆,经回转验证后最终获得26个与CpMYB114L互作的蛋白,共分为4类,包括乙烯响应受体1(CpERS1)、酰基辅酶A硫酯酶13(CpAcots13)、热休克蛋白42(CpHSP42)和叶绿体转运子159(CpTOC159).在果实成熟过程中,CpERS1和CpHSP42表达量先上升后下降,CpAcots13表达量持续上升,CpTOC159表达量剧增后趋于平稳.[结论]推测CpMYB114L与CpERS1蛋白互作参与番木瓜果实成熟的调控.