细粒棘球蚴原头节源外泌体体外刺激髓源抑制性细胞极化的研究

目的 探究细粒棘球蚴原头节源外泌体体外刺激髓源抑制性细胞(MDSC)向M2型巨噬细胞极化的动态变化,并探讨二者协同发挥免疫抑制作用的生物学意义.方法 体外培养细粒棘球蚴原头节并收集培养上清,超速离心上清获得外泌体.透射电镜观察外泌体形态,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测外泌体蛋白CD9和烯醇化酶的表达.取3只健康BALB/c小鼠,制备股骨髓系细胞,刺激分化为MDSC后,分为实验组、阳性对照组和阴性对照组.于6孔板中每孔加入1×106个MDSC细胞,实验组、阳性对照组和阴性对照组分别加入20μl外泌体(5μg)、白细胞介素-4(IL-4)(40 ng)和RPMI 1640培养基进行刺激.于刺激24、48和72 h后,分别收集3组MDSC,采用流式细胞术分析单核型MDSC(M-MDSC)的细胞比例变化及其M2型巨噬细胞分子标志F4/80和CD206的表达情况.采用GraphPad Prism 8.0.2统计学软件进行统计学分析.结果 透射电镜下可见细粒棘球蚴原头节源外泌体为圆形的膜状结构,直径集中在60～90 nm.Western blotting分析结果显示,外泌体有特异性蛋白CD9和烯醇化酶的表达.外泌体刺激MDSC 24 h后,实验组和阳性对照组M-MDSC占MDSC的比例分别为(77.14±0.78)％、(75.74±0.50)％,与阴性对照组的(78.13±0.81)％比较差异均无统计学意义(t=1.24、3.45,P>0.05);刺激48 h后,阴性对照组、实验组和阳性对照组M-MDSC占MDSC的比例分别为(80.47±0.85)％、(78.27±0.69)％和(68.01±1.33)％,其中实验组与阴性对照组比较差异无统计学意义(t=2.48,P>0.05),阳性对照组与阴性对照组比较差异有统计学差异意义(t=11.20,P<0.01);刺激72 h后,实验组和阳性对照组M-MDSC占MDSC的比例分别为(50.03±0.59)％和(46.14±0.87)％,均低于阴性对照组的(74.94±1.53)％,差异有统计学意义(t=21.52、23.18,P<0.01).外泌体刺激MDSC 24 h、48 h和72 h后,实验组和阳性对照组M-MDSC上表达M2型巨噬细胞分子标志的比例分别为(11.83±0.06)％、(12.48±0.12)％,(15.11±0.21)％、(15.42±0.27)％和(29.12±1.34)％、(31.83±1.27)％,均高于阴性对照组的(8.52±1.11)％、(8.79±0.35)％和(15.49±0.26)％,差异均有统计学意义(P<0.05或P<0.01).结论 细粒棘球蚴原头节源外泌体体外可调控M-MDSC向M2型巨噬细胞的极化,且极化随刺激时间进程不断推进.