疟疾蚊媒监测多重PCR方法的建立

目的 建立疟疾消除后高效的蚊媒监测多重PCR方法.方法 设计疟原虫属、人血、中华按蚊和蚊通用4对特异性引物,与通用引物(5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′)连接后,形成4对嵌合特异性引物.常规PCR确定各引物对的最佳退火温度和引物工作浓度,多重PCR优化4对引物混合后的最佳反应条件,引入模拟风险感染阳性蚊虫样品,建立敏感的多重PCR反应体系.检测4种疟疾(间日疟、卵形疟、恶性疟、三日疟)患者全血样品的原虫密度梯度稀释样品的各基因扩增情况,评估检测灵敏度.用溶组织内阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫、田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、刚地弓形虫、日本血吸虫尾蚴、卫氏并殖吸虫、蛔虫、牛带绦虫、猪带绦虫等11种其他寄生虫虫体DNA或感染样品评价该方法的检测特异性.用畜圈周围采集的野生中华按蚊样品,评价所建PCR方法的应用效果.结果 优化后的多重PCR反应体系各组分含量(体积比)为:DNA模板10％、引物Mix10％、三蒸水30％,Taq酶预混液50％.引物Mix中,蚊通用、按蚊、人血和疟原虫引物的用量配比为1:1.75:3:5.反应体系的最佳循环条件为:95℃5 min;94℃15 s,60℃20 s,72℃20 s,循环4次;94℃15 s;64℃20 s,72℃20 s,循环9次;94℃15 s,68℃20 s,72℃24 s,循环25次;72℃3 min;10℃5 min.疟原虫属扩增产物的长度为662～717 bp,人血为519 bp,中华按蚊为432 bp,蚊通用为190～320 bp.4种疟疾患者血样经优化后的多重PCR检测结果显示,该法对间日疟患者血样的灵敏度最高,检出最低原虫密度为10.7个虫/μl血;对三日疟患者血样的灵敏度最低,检出最低原虫密度为133.3个虫/μl血;对卵形疟和恶性疟患者血样的检出最低原虫密度分别为15.0和34.0个虫/μl血;检测灵敏度平均值为48.25个虫/μl血.检测模拟风险感染阳性蚊虫样品结果显示,中华按蚊模拟阳性样品显示为4个条带(662～717、519、432、190～320 bp),吸食人血后的中华按蚊样品为3个条带(519、432、190～320 bp),未吸血或吸食畜血的中华按蚊样品为2个条带(432、190～320 bp),吸人血的非中华按蚊样品为2个条带(519、190～320 bp),未吸血或吸食畜血的非中华按蚊样品为1个条带(190～320 bp).特异性检测结果显示,11种其他寄生虫DNA样品结果均为阴性;对畜圈周围采集的野生中华按蚊样品和室内吸食人血的蚊虫样品检测结果显示,人血引物的特异性良好.结论 本研究建立的疟疾蚊媒多重PCR检测方法,1次检测可同时获取蚊种鉴定、人血指数和疟原虫感染等多方面信息,敏感性高、特异性好.