基于环境DNA的岩原鲤检测及生物量评估

为建立岩原鲤基于环境DNA(eDNA)的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,准确鉴别岩原鲤并探讨eDNA浓度与其生物量的定量关系,实验根据岩原鲤mtDNA中12S rRNA基因序列设计eDNA引物和TaqMan探针,利用PCR扩增出岩原鲤12S rRNA基因的序列,克隆入pMD19-T载体,构建重组质粒作为qPCR标准;使用梯度稀释质粒标准品作为模板,进行qPCR扩增,制作标准曲线,建立岩原鲤qPCR检测方法,并评价其特异性、灵敏性和应用效果.结果显示,引物和TaqMan探针对供试的岩原鲤样品出现荧光增长曲线,显示阳性扩增,而其他鱼类和空白对照均未得到扩增信号,表现为阴性;qPCR的阈值循环数(Ct)与标准品拷贝数的线性关系好,且线性范围广,获得的标准曲线相关系数(R2)达到0.999,检测限位DNA浓度为5×10?6 ng/μL,扩增效率为94.7％;检测养殖不同数量岩原鲤的水体中eDNA浓度,目标DNA浓度和岩原鲤数量存在线性正相关性(R2=0.957),得到岩原鲤DNA浓度与其个体数量的相关性曲线:y=131546x+77623;去除岩原鲤后,eDNA的拷贝数与时间负相关,其在水体环境中的存留时间为17 d.研究表明,该岩原鲤eDNA引物和TaqMan探针既能应用于水体中岩原鲤的定性检测,特异性高、时效性好;又能定量检测出环境中岩原鲤的密度,有利于反映岩原鲤在不同采样点的生物量及时空动态,从而为评价岩原鲤人工放流效果和管理保护资源提供参考.