暗黑鳃金龟碱性磷酸酶HpALP的基因克隆、表达及其与Bt Cry8Ea3的结合特性

[目的]明确苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)晶体蛋白对暗黑鳃金龟Holotrichia parallela幼虫的杀虫机制.[方法]基于暗黑鳃金龟转录组数据,PCR克隆暗黑鳃金龟碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)基因HpALP全长cDNA序列;利用原核表达系统在体外表达HpALP,并进行Western blot检测;利用qRT-PCR测定HpALP在暗黑鳃金龟3龄第2天幼虫不同组织(前肠、中肠、直肠、回肠、马氏管、脂肪体和体壁)中的表达水平;利用配体印记实验及ELISA技术对HpALP蛋白与苏云金芽胞杆菌晶体蛋白Cry8Ea3体外结合特性进行分析.[结果]得到了暗黑鳃金龟HpALP全长cDNA(GenBank登录号:MZ004964),长1 536 bp,编码512个氨基酸,预测蛋白质分子量为57.32 kD,等电点为4.70;HpALP与食粪金龟Onthophagus taurus ALP的氨基酸序列一致性最高;原核表达获得重组蛋白HpALP,经Western blot检测HpALP重组蛋白在IPTG诱导8 h时的表达量最高.qRT-PCR分析的组织表达谱结果表明,HpALP在幼虫前肠中丰度最高.HpALP重组蛋白可以与Cry8Ea3特异结合,解离常数Kd值为76.21±26.44 nmol/L,最大亲合力Bmax值为 0.59±0.068;而 HpALP 重组蛋白与对照 Cry1Ab35 不结合,Kd 值为 142.50±137.30 nmol/L,Bmax值为0.013±0.005.[结论]分离鉴定了暗黑鳃金龟HpALP蛋白,它与Bt Cry8Ea3亲和力强,推断其为Cry8Ea3的受体蛋白.研究结果为明确Cry8Ea3蛋白对暗黑鳃金龟的作用机制提供了理论依据.