不同外周血单个核细胞分离方法对流式细胞术分析结果的影响

目的 探讨3种外周血单个核细胞(PBMC)分离方法对后续流式细胞术分析结果的影响,并比较PBMC冻存前后流式细胞术分析结果.方法 2019年5月,选择四川大学华西医院人类疾病和免疫治疗研究室6位体检健康的工作人员为受试对象,采集每位受试者外周血15 mL,平均分为3份,分别采用Ficoll离心法、羟乙基淀粉(HES)沉降法和HES+Ficoll法分离PBMC.显微镜下观察3种方法分离所得PBMC的形态,并采用细胞计数仪进行细胞计数.分离所得PBMC于冻存前和冻存6个月后行流式细胞术分析,计算PBMC中淋巴细胞所占比例、淋巴细胞中活细胞(FVS780荧光强度小于102为活细胞)所占比例(细胞存活率)和活细胞中CD4+T细胞数与CD8+T细胞数的比值(CD4+T/CD8+T).结果 3种分离方法得到的PBMC形态均一致.与其他2种分离方法相比,HES沉降法分离得到的PBMC除淋巴细胞外还有部分红细胞.HES沉降法所得PBMC数量显著多于Ficoll离心法与HES+Ficoll法(P<0.05);Ficoll离心法所得PBMC数量高于Ficoll+HES法(P<0.05).冻存前和冻存6个月后,Ficoll离心法、HES沉降法和Ficoll+HES法得到的PBMC的存活率比较差异均无统计学意义(P>0.05);HES沉降法得到的PBMC中淋巴细胞比例显著低于Ficoll离心法和HES+Ficoll法(P<0.05);Ficoll离心法与HES+Ficoll法所得到的PBMC中淋巴细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05);Ficoll离心法、HES沉降法与Ficoll+HES法得到的存活细胞中CD4+T/CD8+T比值比较差异无统计学意义(P>0.05).3种方法分离得到的PBMC冻存后淋巴细胞存活率均低于冻存前(P<0.05),PBMC中淋巴细胞比例均高于冻存前(P<0.05);存活细胞中CD4+T/CD8+T比值与冻存前比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 HES沉降法分离得到的PBMC纯度(混有少量红细胞)不如其他2种方法,但其操作更为简便.且无论是冻存前的PBMC还是冻存6个月后的细胞,流式细胞术分析3种方法分离得到的PBMC的结果无统计学差异,因此,HES沉降法适用于抗凝全血的PBMC分离提取.