三色散干预滑膜巨噬细胞焦亡影响背根神经节TRPA1治疗KOA疼痛的离体研究

目的 探讨滑膜巨噬细胞焦亡对背根神经节神经元细胞(DRG)膜上瞬时受体电位TRPA1的影响及三色散的干预作用.方法 提取ICR小鼠滑膜巨噬细胞,用1 μg/mL的脂多糖(LPS)以模拟KOA的炎症微环境;采用CCK-8法检测三色散水提物冻干粉对滑膜巨噬细胞的增殖活性,确定对细胞无毒性的干预浓度;滑膜巨噬细胞分组为正常组、LPS组、三色散组,Western blot法检测滑膜巨噬细胞焦亡相关NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达;qRT-PCR检测滑膜巨噬细胞NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18基因表达;ELISA检测炎症细胞因子(IL-1β和IL-18)水平;提取ICR小鼠DRG细胞,将上述三组细胞上清加入DRG细胞中,另增设一组加入LPS及TRPA1抑制剂,DRG分组为正常上清干预组(A组)、LPS上清干预组(B组)、三色散上清干预组(C组),LPS+TRPA1抑制剂组(D组);βⅢ-tubulin及GFAP免疫荧光鉴定提取的DRG神经元细胞;Western blot法及qRT-PCR检测TRPA1蛋白及基因表达;ELISA检测疼痛因子(CGRP和SP)水平;实时荧光钙成像观察各组DRG神经元细胞钙离子内流情况.结果 确定100 μg/mL三色散水提冻干粉对滑膜巨噬细胞无明显细胞毒性;LPS组NLRP3、Caspase-l、ASC蛋白表达显著高于正常组,低于三色散组(P＜0.05);LPS组NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18基因表达显著高于正常组,低于三色散组(P＜0.05);1PS组细胞上清中IL-1β和IL-18表达量显著高于正常组,低于三色散组(P＜0.05);βⅢ-tubulin及GFAP免疫荧光显示提取的DRG神经元细胞胞体呈圆形或椭圆形,可见神经元之间的轴突呈大量增加,形成稀疏网络状结构;三色散水提冻干粉干预后可抑制B组瞬时受体电位TRPA1蛋白及基因表达水平的上升(P＜0.05),降低B组细胞上清中CGRP和SP表达量;实时荧光钙成像分别观察20、40和60 s的荧光强度发现:B组荧光强度较A组增加(P＜0.05),C组及D组荧光强度较B组降低(P＜0.05).结论 滑膜巨噬细胞焦亡激活DRG膜上TRPA1离子通道参与KOA疼痛反应,而三色散可以抑制滑膜巨噬细胞焦亡及减少DRG细胞TRPA1离子通道上Ca2+内流,发挥减轻KOA疼痛的功效.