缺氧微环境下仙连解毒方抑制结直肠癌细胞增殖的作用及机制

目的:观察缺氧微环境下仙连解毒方对含溴结构域蛋白4(Brd4)诱导的核转录因子-κB(NF-κB)信号通路激活的影响,探讨其抑制结直肠癌细胞HT-29增殖的作用机制.方法:于缺氧培养箱或常氧培养箱中培养人结直肠癌细胞HT-29,给予仙连解毒方(0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8g·L-1)干预细胞48h,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活力;采用线粒体膜电位荧光探针(JC-1)检测仙连解毒方(1.25、2.5、5 g·L-1)对细胞线粒体膜电位的影响,采用流式细胞术检测结直肠癌细胞HT-29凋亡情况;细胞克隆形成实验及5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EDU)法检测结直肠癌细胞HT-29细胞增殖能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测Brd4及其下游蛋白如c-核蛋白类基因(c-Myc)、六亚甲基双乙酰胺诱导蛋白1(HEXIM1)的表达水平,同时检测仙连解毒方对NF-κB信号通路相关蛋白的影响.结果:与空白组比较,仙连解毒方(0.8、1、1.2、1.6、3.2、6.4、12.8g·L-1)组均能抑制结直肠癌细胞HT-29细胞活力(P＜0.05,P＜0.01),且缺氧培养下细胞半数抑制浓度(IC50)＞常氧培养组.与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5g·L-1)组细胞线粒体膜电位明显下降、细胞凋亡增多(P＜0.05,P＜0.01).与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5g·L-1)组细胞克隆数减少,EDU阳性细胞数减少(P＜0.05,P＜0.01).Western blot结果示,与空白组比较,仙连解毒方(1.25、2.5、5g·L-1)组细胞内Brd4、c-Myc蛋白表达量均有不同程度的下降,HEXIM1表达升高(P＜0.05,P＜0.01);磷酸化(p)-NF-KBp65、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(p-IκBα)蛋白表达下调(P＜0.05,P＜0.01).结论:缺氧微环境下仙连解毒方可抑制Brd4调控的结直肠癌细胞HT-29增殖,抑制NF-κB信号通路的激活可能是其机制之一.