牛冠状病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种敏感、特异的牛冠状病毒(BCoV)实时荧光定量RT-PCR检测方法,试验利用GenBank中BCoV参考毒株N基因序列,设计引物及小沟结合物(MGB)探针,建立实时荧光定量RT-PCR方法,对方法的特异性、灵敏度和稳定性进行检验.利用建立的方法对采集自7个省份31个发病牛场的925份临床样本进行检测,并用基于BCoV N基因的普通RT-PCR结合测序的方法对部分阳性样品进行验证.结果表明:建立的实时荧光定量RT-PCR方法的扩增体系为上下游引物(10 μmol/L)各 1 μL,探针(10 μmol/L)0.8 μL,2xOne Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL,Ex Taq HS(5 U/μL)0.4 μL,Prime Script RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL,总 RNA 2 μL,ddH2O 4.4 μL;扩增程序为,42℃5 min;95℃10 s;95℃5 s,55℃35 s,40个循环.标准曲线方程为 y=40.979-3.512x,可信度(R2)为0.999,扩增效率(E)为92.6％,最低检测限为48 copies/pL,重复性变异系数(CV)不超过0.82％.31个发病牛场BCoV阳性场占比为64.52％(20/31),其中腹泻症状阳性场占比为54.55％(12/22),呼吸道症状阳性场占比为65.22％(15/23);阳性样品经基于BCoV N基因的普通RT-PCR方法验证,测序正确.说明建立的BCoV实时荧光定量RT-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、稳定性好,能检测出临床样本中的BCoV核酸,可应用于BCoV感染的诊断、监测与流行病学调查.