人FL-FEN-1基因功能的初步研究

目的:FEN-1是一种结构特异性核酸酶,它识别特定的核酸分叉结构,并切除含有游离5'末端的单链核酸.FEN-1具有对DNA复制和修复都必需的双重功能.对酵母和体外实验的研究表明,在DNA复制过程中,FEN-1去除了冈崎片段前端RNA引物的最后一个核糖核苷;在DNA修复中,FEN-1参与了损伤碱基的修复过程.方法和结果:采用反义核酸技术,从人FEN-1表达质粒hPET-FCH经双酶切得到1084 bp的hFEN-1片段,反向克隆入采用经改建的哺乳动物表达载体pMAMneoAmp ,并得到hFEN-1反义表达质粒pMAMneoAmp FNB .采用改进的磷酸钙介导的细胞转染法,将pMAMneoAmp FNB 和pMAMneoAmp 质粒分别导入FL细胞,用含400 μg/mL G418的MEM完全培养基筛选,分别得到FL-FEN 和FL-M细胞.细胞生长曲线的测定发现,FL-FEN-1 在地塞米松的诱导下,细胞生长速度明显下降,细胞倍增时间TD为3.03 d,而FL和仅含有空载体的FL-M细胞在地塞米松存在下的细胞倍增时间TD分别为2.03 d和2.22 d,不经地塞米松诱导的FL-FEN-1 细胞的TD为2.38 d.采用流式细胞仪对细胞周期的研究表明,在地塞米松诱导下,用不含精氨酸的MEM培养48 h同步化处理后,FL-FEN-1 细胞的S期百分比为9.95%,而FL和FL-M细胞分别为26.31%和23.07%.采用DEAE介导的细胞转染法将穿梭质粒pZ189分别转染经地塞米松诱导的FL、FL-M和FL-FEN-1 细胞,以Hirt's法提取质粒并转化大肠杆菌MBM7070,得到的自发突变率依次为3.91/104、7.79/104和14.4/104.结论:在哺乳动物细胞中FEN-1基因在DNA复制和细胞繁殖的过程中起着重要作用,并且可能参与维持细胞DNA遗传稳定性的过程.