八角枫碱的神经毒性及机制

目的 采用人神经母细胞瘤SH-SY5Y和人神经胶质瘤U251细胞作为体外评价模型,初步探讨八角枫药材中的主要活性成分八角枫碱的神经毒性及其机制.方法 采用CCK-8和中性红摄取实验测定细胞毒性;采用Hoechst 33342核酸染色法检测染色质凝集情况;分光光度法检测胱天蛋白酶3和9的表达水平;Western印迹法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、波形蛋白、Bax、PARP和ERK信号通路蛋白的表达及磷酸化水平;采用维甲酸诱导神经元分化,检测分化的SH-SY5Y细胞神经突生长和退化.结果 与对照组相比,八角枫碱50～2000 mg·L-1能明显抑制U251和SH-SY5Y的细胞生长(P<0.05,P<0.01),作用呈浓度和时间依赖性,24 h的IC50值分别为(770.83±29.95)mg·L-1(U251)和(668.05±9.75)mg·L-1(SH-SY5Y).八角枫碱400 mg·L-1作用于U251细胞24 h后,显著抑制胶质细胞标志物GFAP和波形蛋白蛋白的表达.八角枫碱200,400,600和800 mg·L-1处理24 h后,U251细胞和SH-SY5Y细胞出现明显凋亡形态学改变,表现为细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光;与对照组相比,八角枫碱能剂量依赖性明显增加胱天蛋白酶3和9的酶活性(P<0.05,P<0.01),其中U251细胞内胱天蛋白酶9的酶活力值(U)为7.76±0.06,8.61±0.89,9.23±0.34和7.48±0.30;SH-SY5Y细胞内胱天蛋白酶9的酶活力值(U)为2.15±0.14,2.38±0.45,4.22±0.59和3.15±0.75,胱天蛋白酶3的酶活力值(U)为0.89±0.06,0.96±0.04,1.27±0.32和1.1±0.29.Western印迹法结果显示,八角枫碱能上调Bax表达,促进PARP切割,明显抑制ERK蛋白的磷酸化水平.八角枫碱50,100,200和300 mg·L-1作用于分化的SH-SY5Y细胞24 h后,神经突长度(μm)为80.87±21.37,64.65±14.46,46.58±12.36和15.32±4.61,相对于对照组(87.54±21.68)μm,神经突长度变短(P<0.05,P<0.01),表明八角枫碱可剂量依赖性抑制分化的SH-SY5Y神经突的生长及诱导其神经突退化.结论 八角枫碱能抑制神经细胞及神经胶质细胞的增殖,并抑制神经元轴突的生长,其作用机制可能通过抑制MAPK-ERK通路,上调Bax表达,促进PARP切割,增加胱天蛋白酶3和9活性,从而促进线粒体依赖性细胞凋亡.