Effect of Bushen Huayu Shengxin Decoction(补肾化瘀生新方)on Paracrine Effect and Differentiation Rate of Mesenchymal Stem Cells by Optimizing Ischemic and Hypoxic Microenvironment

目的 观察补肾化瘀生新方优化缺血缺氧微环境对间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)旁分泌效应调控作用,探讨其对MSCs增值分化能力的影响.方法 采用无血清的1640培养基和低氧细胞工作站培养24 h建立缺血缺氧微环境细胞体外模型.随机分为:正常组:以完全培养基培养(L-DMEM+ 10％ FBS);对照组:加入生理盐水血清培养基,放入低氧细胞工作站培养24 h;模型组:以完全培养基培养(L-DMEM+ 10％ FBS),低氧细胞工作站培养24 h;治疗组:加入含有补肾化瘀生新方含药血清培养基,低氧细胞工作站培养24 h.采用液相色谱-串联质谱技术分析鉴定补肾化瘀生新方大鼠体内吸收入血成分.采用流式细胞仪检测MSCs细胞周期、ELISA法检测VEGF、bFGF、SDF-1、IL-10和TNF-α含量变化;免疫细胞化学染色检测NF-κBp65的细胞核转位;实时荧光PCR技术检测microRNA-124a-mRNA表达情况;Western blot检测microRNA-124a蛋白表达;免疫荧光技术检测MSCs向内皮细胞、神经元、神经胶质分化情况.结果 与正常组比较,模型组S期细胞数增多,G0/G1期明显降低(P＜0.05),与模型组比较,治疗组、对照组S期细胞数减少,G0/G1期比例逐渐升高(P＜0.05),与对照组相比,治疗组S期细胞数减少,G0/G1期比例逐渐升高(P＜0.05).与正常组比较,模型组VEGF、bFGF、SDF-1、IL-10降低明显(P＜0.05),与模型组比较,治疗组VEGF、bFGF、SDF-1、IL-10增多明显(P＜0.05),与治疗组相比,对照组VEGF、bFGF、SDF-1、IL-10减少(P＜0.05).随缺血缺氧时间延长VEGF、bFGF、SDF-1、IL-10呈减少动态变化.与正常组比较,模型组NF-κBp65、TNF-α、mi-croRNA-124a-mRNA和蛋白表达增多明显(P＜0.05),与模型组比较,治疗组NF-κBp65、TNF-α、microRNA-124a-mRNA和蛋白表达降低明显(P＜0.05),与治疗组相比,对照组NF-κBp65、TNF-α、microRNA-124a-mRNA和蛋白表达增多(P＜0.05).随缺血缺氧时间延长NF-κBp65、TNF-α、microRNA-124a-mRNA和蛋白表达呈升高动态变化.与正常组比较,模型组GFAP、Ⅲβ-Tubulin、VWF阳性细胞数增多明显(P＜0.05),与模型组比较,治疗组GFAP、Ⅲβ-Tubulin、VWF阳性细胞数增多明显(P＜0.05),与治疗组相比,对照组GFAP、Ⅲβ-Tubulin、VWF阳性细胞数降低明显(P＜0.05).随缺血缺氧时间延长GFAP、Ⅲβ-Tubulin、VWF阳性细胞数呈升高动态变化.补肾化瘀生新方动物含药血清共分析鉴定出阿魏酸、黄芩苷、梓醇、地黄苦苷、甲基异茜草素、大黄素甲醚6个为主要吸收入血成分.结论 补肾化瘀生新方通过优化缺血缺氧微环境调控MSCs旁分泌效应可以提高MSCs增殖、分化能力,其体内吸收入血成分可能是参与此过程发挥药效的物质基础.