解脲脲原体和微小脲原体相对定量荧光PCR方法的建立及应用

目的 建立一种含内参基因的解脲脲原体(Uu)和微小脲原体(Up)相对定量的荧光PCR分型方法,克服标本采样差异对检测结果的影响,了解患者脲原体感染的生物分群及病原载量. 方法 设计Uu和Up检测与分型引物探针,使用人β-globin(BG)作为相对定量内参引物探针,建立Uu、Up和BG的三重荧光PCR方法,使用核酸标准品建立标准曲线,计算宿主细胞中Uu或Up的相对含量,并确定体系Uu和Up检测下限.使用20株Uu,30株Up临床分离株以及22种生殖道常见病原体进行体系灵敏度和特异性验证,并对68例脲原体阳性生殖道标本进行分型和相对定量分析. 结果 建立的荧光PCR方法对Uu和Up的检测限均为10拷贝,20株Uu和30株Up临床分离株均可正确分型,对22种生殖道道常见微生物无交叉反应.68份脲原体阳性临床标本Uu阳性率为35.3％(24/68),Up阳性率58.8％(40/68),Uu+ Up阳性率为5.9％(4/68),分型结果与文献报道的方法一致性为97.1％.标本定量检测显示,Uu阳性标本的中位数为4 076拷贝/103细胞,Up阳性标本的中位数为2 092拷贝/103细胞. 结论 建立荧光PCR分型方法可快速完成Uu和Up分型,获得致病型脲原体诊断结果,并通过相对定量反映宿主细胞粘附的病原体量,克服采样差异对检测结果的影响,更客观地反映脲原体载量和致病力.