乳腺癌中DKKL1的表达、作用及机制探讨

目的:研究Dickkopf样蛋白1(dickkopf-like protein 1,DKKL1)基因在乳腺癌组织和细胞系中的表达水平,探讨DKKL1基因过表达对人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖、迁移的影响及其分子作用机制.方法:采用实时荧光定量PCR检测乳腺癌细胞系、80例人乳腺癌和癌旁组织以及20例正常乳腺组织中DKKL1 mRNA的表达水平;免疫组织化学法检测人乳腺癌组织中DKKL1蛋白的表达水平并分析与患者临床病理特征的相关性.选取表达水平最低的MDA-MB-231和MCF-7细胞,分别转染空载体pcDNA3.1(+)-Flag质粒(作为对照组)和重组pcDNA3.1(+)-Flag-DKKL1质粒(作为实验组)后,采用蛋白质印迹法验证DKKL1蛋白是否过表达;然后分别采用CCK-8法、软琼脂克隆形成实验、吖啶橙/溴化乙锭双染实验和Transwell小室迁移实验检测MDA-MB-231和MCF-7细胞增殖和迁移的变化;并采用蛋白质印迹和实时荧光定量PCR法分别检测DKKL1过表达对上皮-间质转化及下游靶分子表达和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路的影响.结果:人乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7、BT549、MDA-MB-468、T47D和ZR-75-1中DKKL1 mRNA表达水平均明显低于正常乳腺上皮细胞MCF-10A(P值均＜ 0.001).与20例正常乳腺组织和80例配对癌旁组织相比,人乳腺癌组织中DKKL1 mRNA和蛋白表达均明显下调(P值均＜0.01);DKKL1蛋白表达与乳腺癌的淋巴结转移、组织学分级及TNM分期具有明显相关性(P值均＜ 0.05).DKKL1过表达质粒转染后,乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中DKKL1蛋白的表达水平明显上调,而细胞增殖、克隆形成、凋亡和迁移能力均被明显抑制(P值均＜ 0.001).DKKL1过表达可上调上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin) mRNA及蛋白表达水平,同时下调波形蛋白(Vimentin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、Snail、BMI-1、KLF4和CD44 mRNA及蛋白的表达水平(P值均＜ 0.001).DKKL1过表达后活化的β-catenin蛋白、磷酸化的糖原合成酶激酶-3β (glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)蛋白及其下游c-Myc和cyclin D1蛋白的表达水平均明显下调(P值均＜0.001).结论:乳腺癌组织和细胞系中DKKL1表达水平下调,可能通过拮抗Wnt/β-catenin信号通路调控乳腺癌的发展进程.