沉默神经纤毛蛋白1和血管内皮生长因子基因抑制耐药性多形胶质母细胞瘤干细胞的体外实验研究

目的:探讨神经纤毛蛋白1(NRP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)在多形性胶质母细胞瘤(GBM)复发和耐药性中的机制。方法:体外培养人源性GBM1A和GBM22细胞株，通过感染慢病毒shRNA的方式沉默VEGF或NRP-1。根据感染慢病毒shRNA的种类，将两种细胞株分别分为shCont组(感染无义序列shRNA)、shNRP-1组(感染NRP-1慢病毒shRNA)及shVEGF组(感染VEGF慢病毒shRNA)。采用实时荧光定量聚合酶联链式反应(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹法检测肿瘤细胞株在沉默NRP-1或VEGF基因后干细胞标志物[包括：性别决定区Y盒2(Sox2)、表皮生长因子受体(EGFR)、N-钙黏附素(N-cadherin)、CD133、细胞间质上皮转换因子(c-Met)]的基因和蛋白表达情况。采用细胞划痕实验、Transwell小室测定法、神经球形成实验及MTT法检测肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力、神经球形成能力及细胞代谢活性。采用细胞生长抑制实验检测肿瘤细胞株在沉默VEGF或NRP-1后对替莫唑胺(TMZ)、紫杉醇(PTX)和卡博替尼(XL-184)的敏感性。向GBM1A和GBM22细胞株中的shCont组和shNRP-1组分别加入10 μg重组VEGF，分为shCont组、shCont+VEGF组、shNRP-1组、shNRP-1+VEGF组，判断NRP-1与VEGF之间的相互作用。结果:GBM1A细胞株中，shVEGF组和shNRP-1组Sox2、EGFR、N-cadherin，CD133及c-Met的mRNA含量均较shCont组下降(均 P<0.05)。GBM1A细胞株中，shNRP-1组和shVEGF组EGFR、CD133、N-Cadherin的蛋白质相对表达量、24 h和48 h时的细胞划痕愈合率及发生细胞迁移的比例均较shCont组低(均 P<0.05)，但shNRP-1组和shVEGF组间的差异均无统计学意义(均 P>0.05)；GBM22细胞株得到相似的结果。在GBM1A细胞株和GBM22细胞株中，3组细胞活力的差异均无统计学意义(均 P>0.05)。根据绘制的剂量-生长曲线，GBM1A细胞株中，shNRP-1组和shVEGF组TMZ、PTX、XL-184的半抑制浓度(IC 50)均低于shCont组(均 P<0.05)；在GBM22细胞株得到相似的结果(均 P<0.05)。GBM1A细胞株中，shCont组和shCont+VEGF组形成神经球的数量均高于shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组(均 P<0.05)，其中shCont+VEGF组高于shCont组( P<0.05)，而shNRP-1组和shNRP-1+VEGF组间的差异无统计学意义( P>0.05)；GBM22细胞株得到相似的结果。 结论:沉默VEGF或NRP-1基因在不影响GBM本身活力的情况下可有效抑制其干细胞性，降低其迁移能力及侵袭力，并恢复其对化疗药物的敏感性；VEGF介导的细胞迁移可能依赖NRP-1发挥作用。