miR-29a基因敲除对C57BL/6小鼠肾小球结构和功能的影响

目的:观察微小RNA-29a(miR-29a)基因敲除对小鼠肾小球功能和结构的影响.方法:应用CRISPR/Cas9技术,选择C57BL/6 miR-29a基因敲除型(miR-29a knockout,miR-29a KO)小鼠作为实验组,未敲除型小鼠作为野生型(wild-type,WT)对照组(n=30).分别在第3、12和24周收集小鼠24 h尿液.采用考马斯亮蓝染色法进行尿蛋白测定;ELISA测定尿白蛋白和尿肌酐水平,并计算尿白蛋白/肌酐比值(urinary albumin/creatinine ra-tio,UACR).选取3、12和24周的小鼠,采用过碘酸雪夫氏(periodic acid-schiff,PAS)染色法观察肾脏组织的病理变化;通过透射电镜以及冷冻蚀刻电镜观察肾小球超微结构.另取2组24周的小鼠,一组小鼠腹腔麻醉后用Dyna-beads?M-450 Tosylactivated微磁珠经心脏灌流后分离肾小球,用于RNA和蛋白的提取;另一组小鼠肾脏用于免疫荧光染色.采用RT-qPCR、免疫荧光染色以及Western blot检测小鼠肾小球足细胞标志性蛋白nephrin和podocin以及肾小球IV型胶原(COL4α3、COL4α4和COL4α5)和层粘连蛋白β2(lamininβ2,LAMB2)的表达.结果:考马斯亮蓝染色法实验结果显示,miR-29a KO组小鼠出现尿白蛋白,WT组小鼠无蛋白尿.UACR结果显示3周时,miR-29a KO组与WT组相比,数据无统计学差异;12周时,miR-29a KO组的UACR比值与WT组相比显著增高(P<0.01);24周时,UACR比值差异更加显著(P<0.01).PAS染色显示,3周时,miR-29a KO组小鼠肾小球出现轻微的细胞外基质沉积和系膜增生,随着周龄的增加,miR-29a KO组小鼠肾小球出现胶原纤维沉积,系膜扩张和外周血管壁增厚.透射电镜显示,miR-29a KO组小鼠肾小球超微结构在3周开始出现改变,包括足突排列紊乱,轻微融合等现象;12周时足突数量减少、足突融合加重,肾小球基底膜增厚的程度加重;24周时,上述变化进一步加重.与WT组小鼠相比,miR-29a KO组小鼠足细胞标志性蛋白nephrin的表达在mRNA水平显著下调(P<0.05);podocin表达在mRNA水平也呈下降趋势,但结果无统计学意义;COL4α3/α4/α5以及LAMB2表达在mRNA水平明显上调(P<0.05).West-ern blot结果显示,与WT组小鼠相比,miR-29a KO组小鼠nephrin和podocin蛋白表达显著降低(P<0.05);COL4α3/α4/α5以及LAMB2表达显著增加(P<0.01).肾小球免疫荧光结果和Western blot结果一致.结论:miR-29a基因敲除会导致小鼠出现蛋白尿、肾小球损伤及纤维化,随着小鼠的老龄化损伤程度加重.