基于CRISPR-Cas12a蛋白的副溶血弧菌及tdh基因检测分析

目的 将重组酶介导等温核酸扩增技术(RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统相结合,建立一种快速检测并分型副溶血弧菌的检测方法.方法 通过纯化CRISPR相关蛋白Cas12a,设计和合成RAA引物、crRNA和单链DNA报告分子,建立副溶血弧菌的荧光和试纸条检测方法.采用煮沸法提取细菌核酸,经RAA扩增后产物加入CRISPR-Cas12a检测系统,测试该方法的灵敏性和特异性.结果 本研究检测了 110株副溶血弧菌和121株其他肠道致泻性细菌,符合率为99.1％,最低检测菌量为103 CFU/mL,CRISPR-Cas12a最低检测核酸浓度为77.5 pmol/L,灵敏性高于琼脂糖凝胶电泳法.对于50株携带tdh 和12株不携带tdh 的副溶血弧菌,仅1株tdh+副溶血弧菌未被鉴定出,鉴定成功率为98.4％.结论 本研究建立的CRISPR-RAA检测系统可快速、简单地检测副溶血弧菌及tdh基因,且有较强的特异性和灵敏性.