去甲斑蝥素对神经母细胞瘤细胞增殖的影响

目的 探讨去甲斑蝥素(norcantharidin,NCTD)对神经母细胞瘤细胞增殖的影响及其对C-MYC基因表达的调控作用.方法 采用实时荧光定量PCR法检测人神经母细胞瘤细胞SK-N-BE、SK-SY5Y、CHLA-119、SK-N-AS及人星形胶质细胞NHA c-Myc mRNA相对表达量,选择与NHA细胞c-Myc mRNA相对表达量差异最大的SK-N-AS细胞进行后续试验.对数生长期SK-N-AS细胞分为NCTD组(给予50 μmol/L NCTD处理)和对照组(加入等体积细胞培养液),采用MTS法检测2组培养第1～5天细胞增殖的吸光度值,采用BrdU摄入实验检测2组培养第1天细胞BrdU摄入指数,采用实时荧光定量PCR法检测2组培养第4天c-Myc mRNA相对表达量,采用Western blot法检测2组培养第4天细胞c-Myc蛋白相对表达量.构建C-MYC基因的慢病毒过表达质粒和空白对照慢病毒质粒,将对数生长期SK-N-AS细胞分为NCTD+c-Myc组(加入50 μmol/L NCTD及转染c-Myc过表达慢病毒质粒)、NCTD对照组(加入50 μmol/L NCTD)、空白对照组(转染空白对照慢病毒质粒),采用MTS法检测3组培养第1～5天细胞增殖的吸光度值,采用Western blot法检测3组培养第4天细胞c-Myc蛋白相对表达量.结果 SK-N-BE、SK-SY5Y、CHLA-119、SK-N-AS细胞 c-Myc mRNA 相对表达量(2.04±0.34、2.34±0.55、2.70±0.76、4.54±0.58)均高于 NHA 细胞(1.02±0.23)(P＜0.05),SK-N-AS细胞c-Myc mRNA相对表达量与NHA细胞差异最大,选择SK-N-AS细胞进行后续实验.培养第3～5天,NCTD组细胞增殖的吸光度值均高于对照组(P＜0.05);培养第1天,NCTD组细胞BrdU摄入指数(0.56±0.12)低于对照组(1.11±0.25)(t=3.429,P=0.027);培养第4天,NCTD 组细胞 c-Myc mRNA(0.53±0.19)和 c-Myc蛋白(0.11±0.00)相对表达量均低于对照组(0.96±0.16、1.00±0.01)(t=3.086,P=0.003;t=133.900,P＜0.001).培养第3～5天,空白对照组和NCTD+c-Myc组细胞增殖的吸光度值高于NCTD对照组(P＜0.05),NCTD+c-Myc组与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);培养第4天,NCTD+c-Myc组和空白对照组细胞c-Myc蛋白相对表达量(0.79±0.12、0.83±0.05)均高于 NCTD 对照组(0.44±0.23)(P＜0.05),空白对照组与 NCTD+c-Myc 组比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 NCTD通过抑制C-MYC基因的表达抑制神经母细胞瘤细胞增殖.