子宫内电穿孔转染胎鼠脑室管膜下区神经干细胞的条件优化

背景:神经干细胞是一群可以自我增殖并具有多向分化潜能的细胞.子宫内电穿孔转染可将RNA或质粒瞬时转入活体小鼠神经干细胞内对目的基因进行干扰或过表达,是目前活体研究大脑皮质发育的最直接可靠的研究方法.目的:以胚胎小鼠脑室管膜下区的神经干细胞为目标,以增强型绿色荧光蛋白作为报告基因,优化子宫内电穿孔转染的条件,为研究大脑皮质的发育提供更加有效的方法.方法:将成年ICR小鼠以1只雄鼠和3只雌鼠的比例进行交配,晚上8点将小鼠合笼,第2天早晨8点查验雌鼠阴栓,将有阴栓的雌鼠计为怀孕0.5 d.待怀孕14 d(E14)时腹腔注射Ketamin(120 mg/kg)和Xylazine(10 mg/kg)麻醉孕鼠,剃掉孕鼠腹部毛发,打开腹腔,不剪开孕鼠子宫,用ECM803电穿孔转染仪和BTX电极在不同的电压下将pEx-4-eGFP质粒在电场的作用下瞬时转入胎鼠脑室管膜下区的神经干细胞内.转染3 d后取出转染小鼠脑组织进行冰冻切片,观察增强型绿色荧光蛋白在大脑皮质上的表达,统计绿色荧光蛋白阳性细胞数来评估转染效率.结果 与结论:①电转电压在38,40,42,45 V时小鼠存活及转染效果不同,38 V电压对胎鼠的致死性较小,但是转染效率较低,在42 V电压下电转的小鼠可存活,且电转的脑组织中绿色荧光蛋白荧光强度高于40 V电压,但是45 V电压对小鼠的致死性较大.因此,42 V电压是一个较好的电转条件.②在电压42 V条件下,脉冲数由5个改为8个后绿色荧光蛋白阳性细胞更多,荧光更亮.③改良后的电转条件对转染成功的细胞生长无影响.