褪黑素预处理的骨髓间充质干细胞外泌体促进骨髓间充质干细胞成骨

背景:骨质疏松是一种以骨量减少、骨微结构改变为主要特征的全身性代谢疾病,现有的药物治疗效果有限且不良反应明显,而骨髓间充质干细胞来源外泌体因其非免疫原性等优势,有望成为治疗骨质疏松的新方法.目的:探讨褪黑素预处理骨髓间充质干细胞后提取的外泌体对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及作用机制,分析其作为无细胞方式促进成骨治疗骨质疏松的可行性.方法:采用全骨髓贴壁法分离大鼠原代骨髓间充质干细胞并鉴定;超高速离心法提取骨髓间充质干细胞中的外泌体(NC-Exos)和褪黑素预处理骨髓间充质干细胞中的外泌体(MT-Exos)并鉴定;共聚焦显微镜下观察骨髓间充质干细胞对外泌体的摄取情况.骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基中培养,分别以MT-Exos和NC-Exos处理骨髓间充质干细胞,以PBS处理骨髓间充质干细胞为空白对照组.采用碱性磷酸酶活性、茜素红染色评估各组骨髓间充质干细胞成骨分化效果,Western blot和RT-qPCR分别检测各组骨髓间充质干细胞中碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2的蛋白和mRNA表达;Western blot检测骨髓间充质干细胞中Wnt1和β-catenin的蛋白表达.结果 与结论:①骨髓间充质干细胞呈典型纺锤样形态且具备三系分化能力;外泌体的直径大多数小于150 nm,且均表达外泌体特异性标记蛋白CD9、CD63和CD81,能够被骨髓间充质干细胞摄取;②成骨诱导7 d后,相较于NC-Exos处理组,MT-Exos处理组显示出更高的碱性磷酸酶活性(P<0.01),碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2的蛋白和mRNA表达(P<0.05),Wnt1、β-catenin蛋白表达(P<0.001);③成骨诱导14 d后,相较于NC-Exos处理组,MT-Exos处理组显示出更多的红色钙结节;④上述实验结果表明,MT-Exos通过激活Wnt1/β-catenin信号通路显著促进骨髓间充质干细胞成骨分化.