腓骨蛋白-1在血管平滑肌细胞衰老相关钙化中的作用及机制研究

目的:探讨腓骨蛋白-1(Fibulin-1)在高磷诱导的大鼠平滑肌细胞衰老相关钙化过程中的作用及其机制。方法:2020年9月至2021年9月自10只6~8周的雄性SD大鼠胸主动脉和腹主动脉提取大鼠原代血管平滑肌细胞。采用磷酸盐(2.5 mmol/L Pi)刺激大鼠平滑肌细胞钙化作为应激性衰老相关钙化模型。通过β-半乳糖苷酶染色评估细胞衰老。通过茜素红染色和细胞钙含量测定判断细胞钙化程度。蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测平滑肌细胞在衰老相关钙化过程中发生表型转化的指标和Fibulin-1表达水平。使用siRNA敲低原代大鼠平滑肌细胞中Fibulin-1表达，免疫荧光检测Psmad3的表达，Western Blot检测Fibulin-1对平滑肌细胞表型转化指标的影响。用重组Fibulin-1培养，并同时加入转化生长因子(TGF)-β抑制剂A83-01和Psmad3抑制剂SIS3，通过Western Blot检测平滑肌细胞衰老和钙化指标。结果:在磷酸盐刺激大鼠平滑肌细胞钙化的应激性衰老模型中，Fibulin-1的表达上调( t＝11.20， P<0.01)，平滑肌细胞收缩表型标志物MHC、SM22α表达下调( t值分别为7.97、10.27，均 P<0.01)，成骨表型标志物OPN、Bmp2和衰老标志物P53的表达上调( t值分别为4.80、9.56、14.07，均 P<0.01)。Fibulin-1敲低后改善了细胞衰老程度和钙沉积( t＝12.90， P<0.05)、降低了平滑肌细胞表型转化蛋白OPN、Bmp2和衰老蛋白P53的表达( t值分别为5.92、10.15、8.28， P<0.05或 P<0.01)，同时TGF-β/信号转导蛋白(Smad3)及Psmad3表达被抑制( t值分别为12.90、7.46，均 P<0.01)。加入TGF-β/Smad3通路抑制剂后，重组Fibulin-1对平滑肌细胞表型转化蛋白OPN、SM22α和衰老标志蛋白表达P53的促进作用减弱( t值分别为4.52、9.82、3.85， P<0.01或 P<0.05)。 结论:Fibulin-1可通过TGF-β/smad3信号通路促进血管平滑肌细胞发生衰老相关钙化。