紧密连接蛋白Occludin影响牛病毒性腹泻病毒感染

为了研究紧密连接蛋白Occludin(OCLN)在调控牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)胞内复制中的重要作用.使用Benchling平台设计OCLN的向导RNA(short guide RNA,sgRNA)序列,克隆至LentiC-RISPR V2质粒中,包装慢病毒后感染牛肾细胞(madin-darby bovine kidney,MDBK),使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,使用Western blot检测OCLN敲除情况,建立OCLN敲除MDBK细胞系;于BVDV感染OCLN KO细胞不同时间,使用荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和免疫荧光染色(immunofluores-cence,IF)检测BVDV 5'非编码区(untranslated region,UTR)mRNA 和双链RNA(double strand RNA,dsRNA)水平;使用Reed-Muench法测定BVDV感染OCLN KO细胞不同时间后病毒滴度;使用倒置显微镜观察BVDV感染OCLN KO和MDBK细胞不同时间后致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)情况;使用qRT-PCR检测OCLN KO细胞中BVDV吸附和内化情况.结果发现,与Scramble处理组相比,OCLN KO细胞中OCLN蛋白表达显著性降低,BVDV 5'UTR mRNA和dsRNA水平显著性降低,BVDV滴度显著性降低,BVDV感染造成的细胞CPE明显减弱,BVDV吸附和内化作用明显减弱.表明()CLN敲除后显著性抑制BVDV通过吸附和内化作用进入MDBK细胞,将为抗BVDV的新方法和技术建立提供依据和重要靶点.