水貂阿留申病毒诱导CrFK细胞凋亡信号通路的研究

本实验室前期研究表明水貂阿留申病毒(AMDV)G株感染猫肾细胞(CrFK)可以引起其凋亡,为研究AMDV在体外通过何种途径诱导CrFK细胞的凋亡,本实验采用MOI 1的AMDV G株感染CrFK细胞,于感染后不同时间(2h、12h、24 h、36 h、48 h和60 h,下同)通过分光光度法检测试剂盒检测Caspase-8、Caspase-9的活性;利用western blot检测Caspase-8和Caspase-9蛋白的表达情况.采用Caspase-8和Caspase-9抑制剂处理CrFK细胞后感染AMDV G株,于不同时间检测Caspase-3的活性.于AMDV G株感染CrFK细胞后不同时间,利用荧光定量PCR检测细胞中死亡受体通路分子Caspase-8、Fas、FasL和线粒体通路分子Caspase-9、Bax、Bcl-2、Cyt C以及凋亡执行因子Caspase-3的mRNA转录水平;采用JC-10线粒体膜电位试剂盒检测各时间点细胞线粒体膜电位的去极化情况.结果 显示,AMDV G株感染CrFK细胞后不同时间Caspase-8的活性均无明显变化,而Caspase-9的活性则随感染时间的延长而明显增强;western blot结果显示,Caspase-8蛋白的表达不受影响,而Caspase-9在AMDV感染后12 h被切割活化.Caspase-3活性的检测结果显示,抑制CrFK细胞中Caspase-8的活性后再感染AMDV,Caspase-3的活性逐渐增强,而抑制细胞中Caspase-9的活性后再感染AMDV,则Caspase-3的活性无明显变化,即抑制了Caspase-9再感染AMDV并不能诱导细胞凋亡;荧光定量PCR结果显示,AMDV感染CrFK细胞后不同时间Caspase-8、Fas、FasL基因的转录水平均无明显变化,而Caspase-9、Caspase-3、Cyt C基因mRNA转录水平及Bax/Bcl-2的比值则随感染时间的延长而逐渐升高.线粒体膜电位结果显示,AMDV感染的CrFK细胞线粒体膜电位下降,发生了明显去极化现象,表现为细胞发生了凋亡.综上,本研究首次证实AMDV G株感染CrFK细胞后激活了线粒体途径的细胞凋亡执行分子Caspase-3及线粒体通路相关基因Bax、Bcl-2、Caspase-9和Cyt C,并未激活死亡受体通路相关分子,AMDV G株是通过激活细胞线粒体通路而诱导CrFK细胞的凋亡.本研究为AMDV感染CrFK细胞凋亡机制的研究奠定了基础.