黄独胚性悬浮细胞的小滴玻璃化法超低温保存

[目的]建立和优化黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存的技术体系.[方法]通过单因子试验探究各种条件对黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存效果的影响,并通过RAPD分子标记检测其冻后再生苗的遗传稳定性.[结果]黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存较佳的技术体系如下:黄独胚性悬浮细胞(25±1)℃下在MS+2 mg/L KT +0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L2,4-D +0.8 mol/L蔗糖的液体培养基中预培养4d;(25±1)℃下在装载液(MS+2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖,pH 5.8)中装载70 min;0℃下在PVS2(300 g/L甘油+150 g/L乙二醇+150 g/L二甲基亚砜+0.4 mol/L蔗糖,pH 5.8)中脱水100 min;冻后铝箔条浸入37℃恒温预热过的培养液(MS +KT2 mg/L+NAA0.5 mg/L +2,4-D 0.5 mg/L+ 30 g/L蔗糖,pH5.8)中化冻;(25±1)℃下用洗涤液(MS+ KT 2 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L+ 1.2 mol/L蔗糖,pH5.8)进行洗涤,洗涤3次,每次洗涤时间为10 min;洗涤后先黑暗培养5d再置于光周期下培养.黄独胚性悬浮细胞冻后相对存活率为90.5％±4.4％.液氮保存时间对黄独胚性悬浮细胞冻后存活率无显著影响.RAPD检测结果表明黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存再生植株无变异,未发现遗传稳定性发生变化.[结论]本试验建立的黄独胚性悬浮细胞小滴玻璃化法超低温保存技术程序较为可靠,可为黄独胚性悬浮细胞的长期保存提供技术参考.