奶牛乳腺上皮细胞中bta-miR-29b实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了检测金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的奶牛乳腺上皮细胞(bMECs)中bta-miR-29b表达,本研究建立bta-miR-29b实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行评估,利用该方法检测金黄色葡萄球菌感染bMECs中bta-miR-29b的表达水平.结果 显示,构建的RT-qPCR方法在bta-miR-29b标准品10 pg/20 μL～1×10-4 pg/20μL浓度范围内,初始模板量和Ct值之间呈现良好的线性关系,线性相关系数R2=0.9997.特异性试验结果显示,对bta-miR-29b标准品样本检测结果为阳性,对牛大肠杆菌和链球菌样本检测结果均为阴性,说明该方法特异性强;敏感性试验结果显示,对bta-miR-29b标准品的最低检测模板浓度为1×10-4 pg/20 μL,比常规PCR检测的敏感性高100倍,表明该方法敏感性高;重复性试验结果显示,组内和组间的变异系数均小于1％,说明该方法重复性好.临床样本的检测结果显示,金黄色葡萄球菌感染bMECs后第24小时bta-miR-29b的表达量极显著下调(P＜0.01).上述结果表明,本研究建立的RT-qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,能够准确检测金黄色葡萄球菌感染bMECs中bta-miR-29b的表达,为今后bta-miR-29b的表达分析及其生物学功能的研究提供了研究手段.