牦牛乳腺上皮细胞的体外分离培养及鉴定

为提高牦牛乳腺上皮细胞体外培养成功率,实现高度可重复性,试验采用2.5 g/L(含0.5 g/L EDTA)胰酶和Ⅰ型胶原酶(1 mg/mL)分段消化牦牛乳腺组织块以分离细胞,原代培养时于DMEM/F12培养体系内添加氢化可的松(1 μg/mL)、表皮生长因子(50 ng/mL)及胰岛素-转铁蛋白-硒(5 μg/mL),传代时用牦牛乳腺上皮细胞与成纤维细胞对胰酶敏感度及贴壁时间的差异特性进行纯化.采用CCK8法测定细胞生长曲线,细胞免疫荧光技术鉴定细胞分子表型,Western blot技术对细胞进行功能鉴定.结果显示,组合酶分段消化法可获得较多细胞量,激素添加有利于促进细胞贴壁及增殖,分离纯化后的细胞具有正常生长特性,经分子表型及功能鉴定纯化后的细胞可阳性表达角蛋白18及β-酪蛋白,阴性表达角蛋白14及波形蛋白,上述3种激素存在时,细胞可在蛋白质水平表达μ-酪蛋白,催乳素可促进其表达,说明成功培养了具有泌乳功能的牦牛乳腺上皮细胞,建立了有效的牦牛乳腺上皮细胞体外培养技术体系,可为以后的相关研究提供参考.