黑曲霉β-甘露聚糖酶ManA耐热突变体的筛选

为了改造黑曲霉(Aspergillus niger)来源的β-甘露聚糖酶ManA,获得耐热性高的突变体.利用易错聚合酶链式反应(PCR)技术对构建的表达质粒pGAPZαA-manA进行随机突变,将突变文库转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,表达筛选耐热性高的突变体,并进一步对突变位点进行定点突变,筛选其他耐热性高的突变体.结果表明,ManA的H283R与H283K突变体相对于野生型在耐热性方面有显著提升,75℃加热30 min其相对酶活由26.66％分别提升至76.95％和83.57％;在pH 3.0～9.0的条件下,50℃保存24 h,H283K突变体与野生型的相对酶活均在90％以上,H283R突变体在pH 3.0时的相对酶活下降到了84.72％,两个突变体的最适温度、pH及比酶活与野生型没有明显差异.说明β-甘露聚糖酶ManA的283位组氨酸(H283)对其耐热性较为关键,将该位点突变为精氨酸(R)和赖氨酸(K)时,ManA的耐热性得到显著提升.