猪CD163基因的单碱基编辑研究

旨在利用YE1-BE3-FNLS载体对猪的CD163基因进行C＞T的单碱基突变,形成终止密码子TAA,从而导致CD163基因翻译的提前终止.利用网站在猪CD163基因的第7外显子筛选到高效率的sgRNA序列使其符合C5位点,并且C5后续的两个碱基为A A,CAA与起始密码子ATG之间的碱基数为3的整数倍.PCR扩增CD163-sgRNA 和 YE1-BE3-FNLS 载体中的 APOBEC-Cas9n-UGI 片段,通过体外转录形成 CD163-sgRNA 和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA.体外培养猪卵母细胞并进行孤雌激活,利用显微操作仪对孤雌胚胎进行CD163-sgRNA和APOBEC-Cas9n-UGI mRNA注射,待胚胎发育至桑椹胚和囊胚阶段,提取胚胎基因组DNA对单碱基编辑区域进行PCR扩增测序.结果显示,在49个候选sgRNA中成功筛选出一个CD163-sgRNA,利用PCR成功扩增了 CD163-sgRNA 和 APOBEC-Cas9n-UGI 片段,注射 CD163-sgRNA 和 APOBEC-Cas9n-UGI mRNA 后的猪孤雌胚胎发育到2～4细胞期.挑选注射的20个2～4细胞期胚胎经过PCR扩增与产物测序后发现有12个胚胎的CD163基因的第7外显子的预期位点C(num1479)＞T,单碱基编辑效率约60％.对CD163-sgRNA的off-tar-get 分析发现,在错配3个碱基的情况下该CD163-sgRNA有5个off-target区域,对这5个区域进行PCR扩增和sanger测序分析后发现都没有发生C＞T的突变.本研究利用YE1-BE3-FNLS工具在胚胎水平上对猪的CD163基因进行了单碱基编辑,成功使得该基因第7外显子预期位点(num1479)C变为T,从而使得密码子CAA变为TAA,可提前终止CD163基因的翻译.