山羊Zfy基因克隆分析及其敲除载体构建

旨在对西农萨能奶山羊Zfy基因进行克隆和生物信息学分析,并利用CRISPR/Cas9技术成功获得敲除Zfy基因的奶山羊成纤维细胞株,为进一步探索Zfy基因功能及性别调控提供基础数据.本研究以健康的西农萨能奶山羊为对象,采集3只3月龄公山羊睾丸组织并提取总RNA.根据NCBI中预测的山羊Zfy基因mRNA序列信息(GenBank登录号:XM_018044893)设计引物,利用RT-PCR技术分段克隆获得山羊Zfy基因序列,使用相关生物信息学软件分析Zfy基因CDS区核苷酸序列并预测其蛋白质的结构和功能.针对山羊Zfy基因CDS区共设计了4条sgRNA,构建4个打靶载体并转染山羊胎儿成纤维细胞(GFFs),利用T7E1酶切检验打靶载体的切割效率,通过嘌呤霉素筛选敲除Zfy基因的GFFs阳性单克隆细胞,经PCR扩增、测序检测突变率.结果显示,成功克隆得到了长度为2 406 bp的西农萨能奶山羊Zfy基因CDS区序列.同源性以及系统进化树分析表明,山羊Zfy基因序列与马鹿、牛、绵羊的同源性高,亲缘关系较近,与小鼠的同源性最低,亲缘关系最远.生物信息学软件分析显示,山羊Zfy基因共编码801个氨基酸,分子质量为90.37 ku,Zfy蛋白含66个磷酸化位点,等电点为5.66,亲水性较高,无信号肽,是一个结构不稳定的非分泌蛋白.T7E1酶切发现,4个打靶载体均可发挥敲除活性,切割效率分别为12.31％、40.86％、31.52％、26.37％.选择切割效率最高的打靶质粒转染山羊胎儿成纤维细胞(GFFs),经嘌呤霉素筛选获得能稳定靶向敲除Zfy基因的GFFs阳性细胞株,PCR测序检测突变率为23.91％.综上所述,本研究成功克隆了西农萨能奶山羊Zfy基因并揭示了该基因所编码蛋白的理化性质;成功构建了山羊Zfy基因CRISPR/Cas9敲除载体,并筛选出最佳敲除位点,获得了Zfy基因敲除的亚克隆细胞,为深入研究山羊Zfy基因功能及开发性别控制技术奠定了基础.