中华蜜蜂NPC1蛋白AcNPC1的原核表达、多克隆抗体制备及功能鉴定

[目的]人类C型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C,NPC)主要是由NPC1基因突变引起的一类遗传疾病.NPC1蛋白主要负责胞内胆固醇运输,同时也作为病毒侵染宿主细胞的重要受体之一近年来备受关注.本研究旨在探究NPC1蛋白与中华蜜蜂囊状幼虫病毒(Chinese sacbrood virus,CSBV)感染的关系.[方法]通过PCR扩增中华蜜蜂Apis cerana cerana AcNPC1基因;将其克隆至pET-30a原核表达载体,转化至大肠杆菌Escherichia coli RosettaTM(DE3)进行IPTG诱导表达,采用镍柱纯化重组蛋白,免疫小鼠制备多克隆抗体.设计并合成AcNPC1 siRNA,添食中华蜜蜂幼虫;运用RT-qPCR检测和分析中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1的表达量,以及RNAi干扰后不同时间AcNPC1基因和CSBV病毒衣壳蛋白VP1基因在感染CSBV的中华蜜蜂幼虫中的表达水平.[结果]成功构建重组表达质粒pET-30a-AcNPC1,在大肠杆菌中获得高效表达的重组蛋白,目的蛋白大小约为36 kD,经亲和纯化获得了纯度较高的重组蛋白,免疫小鼠成功制备了多克隆抗体,免疫印迹分析发现AcNPC1抗体能杂交到两条带,有可能是在提取膜蛋白过程中该蛋白发生了部分降解.中华蜜蜂CSBV添毒幼虫中AcNPC1表达与正常幼虫中的相比,在12,24和48 h并无显著变化,在72 h出现显著上调.RNAi实验结果表明,中华蜜蜂正常幼虫添食24 h后AcNPC1的3个干涉片段(siRNA1,siRNA2 and siRNA3)均对AcNPC1具有显著性下调作用,AcNPC1表达分别下调了73.20％,72.81％和54.78％;给CSBV添毒幼虫分别添食3个干涉片段,AcNPC1 表达分别下调了43.90％,59.85％和57.67％.CSBV VP1 基因在干扰AcNPC1 基因72 h后表达下调了67.65％.[结论]利用原核表达系统能有效地在体外表达中华蜜蜂AcNPC1,并制备了其多克隆抗体.利用体外合成的siRNA对中华蜜蜂幼虫中AcNPC1的表达进行干扰,表明在蜜蜂中通过饲喂的方式进行RNAi可以成功下调靶标基因表达水平.不过,RNAi实验结果提示AcNPC1表达下调后可能并不直接影响CSBV的感染.本研究为进一步阐明AcNPC1的潜在功能打下了基础.