农杆菌介导的杜梨叶片瞬时转化方法的建立

[目的]探寻一种由农杆菌介导的杜梨叶片瞬时转化的最佳方法.[方法]以杜梨组织培养的幼嫩叶片为材料,将含有GUS基因的pBI121植物表达载体转化农杆菌GV3101和EHA105,设计3因子3水平正交试验L9(33),采用不同农杆菌菌液浓度、不同真空渗入时间,侵染叶片组织细胞,取不同时间共培养后的叶片观察GUS染色情况.[结果]GV3101和EHA105均能高效侵染转化杜梨叶片,使GUS蛋白表达,但其转化效率不同.农杆菌GV3101在菌液OD600为0.8,真空渗入20 min,共培养4d后,杜梨叶片的转化效率即可达到100％,且叶片坏死率仅为13.09％;EHA105在OD600为0.8,真空渗入30 min,共培养6d,或菌液OD600为1.0,真空渗入10 min,共培养2d的条件下转化效率最高,均为83.33％,但是,叶片坏死率分别为27.78％和15.26％,然而在菌液OD600为1.0,真空侵染时间20 min,共培养4d后,叶片转化效率为75.79％,但叶片坏死率大大降低,仅为5.00％.[结论]菌株GV3101和EHA105均能高效侵染转化杜梨叶片,最高转化效率分别为100％和83.33％,所以菌株GV3101转化效率高于EHA105.考虑到叶片坏死率,菌株GV3101瞬时转化杜梨叶片的最适条件为:菌液OD600为0.8,真空渗入时间20 min,共培养4d,转化效率100％,叶片坏死率13.09％;菌株EHA 105瞬时转化杜梨叶片的最适条件为:菌液OD600为1.0,真空渗入20 min,共培养4d,转化效率75.79％,叶片坏死率5.00％.