小麦TaTDR-Like基因的克隆及表达分析

[目的]克隆小麦绒毡层退化基因(Tapetum degeneration retardation,TaTDR-Like),研究其组织表达及不同育性材料间花药不同发育时期的时空表达模式,为深入揭示小麦花药异常发育的分子机制打下理论基础.[方法]以普通小麦品种西农1376(MF-XN1376)为材料,通过PCR扩增克隆得到TaTDR-Like基因的3个同源拷贝,利用生物信息学分析TaTDR-Like蛋白特性及TaTDR-Like基因启动子顺式作用元件,利用实时荧光定量PCR检测TaTDR-Like基因的组织表达情况及在可育、不育材料花药不同时期中的时空表达模式,利用酵母双杂交技术进行自激活检测,并构建植物融合表达载体35S-TaTDRLD-EGFP,通过农杆菌介导转入烟草叶片表皮细胞,观察TaTDRL-D蛋白亚细胞定位情况.[结果]成功克隆小麦TaTDR-Like基因,发现该基因存在3个同源拷贝即TaTDRL-A、TaTDRL-B和TaTDRL-D,分别编码550、553、557个氨基酸,其蛋白分子量分别为58.50、58.90和59.21 kD,等电点(pI)分别为4.77、4.66和4.63.TaTDR-Like蛋白均在C端有1个bHLH保守结构域,其中TaTDRL-A与TaTDRL-B的保守结构域相似度达100％,与TaTDRL-D的保守结构域相似度为96％,TaTDRL-D与OsTDR、AtAMS保守结构域相似度分别为98％和88％;系统发育进化树表明TaTDR-Like蛋白与大麦(KAE8787147.1)、二穗短柄草TDR(XP_014756384)、水稻TDR(Os02g0120500)和拟南芥AMS(AT2G16910.1)的进化关系较密切;启动子分析表明TaTDR-Like基因启动子处含有较多光响应元件、非生物应激反应、激素响应元件等顺式作用元件;组织特异性表达分析显示TaTDRL-D在花药中的表达量最高,而TaTDRL-A和TaTDRL-B在幼穗表达量较高;对花药发育不同时期表达分析显示TaTDRL-D在花药发育单核早期表达量最高,之后逐渐降低,单核晚期到三核期不育材料(CMS-XN1376)表达量均高于可育材料(MF-XN1376);自激活检测结果表明TaTDRL-D具有转录激活活性;亚细胞定位显示TaTDRL-D蛋白定位于细胞核.[结论]TaTDRL-D基因可能参与小麦花药发育,负调控花药育性.