鲤IL-17N的基因克隆、表达及促炎作用

白细胞介素17(Interleukin-17,IL-17)在炎症和宿主防御中起重要作用.为了解鲤(Cyprinuscarpio)IL-17N基因的功能,本研究使用同源搜索和基因克隆的方法在鲤基因组挖掘鉴定到两个IL-17N基因(CcIL-17Na和CcIL-17Nb),均由TOP3B基因内含子2的互补序列编码.共线性比较显示,除了东方红鳍鲀(Takifuga rubripes)外,在其他已研究的鱼类中,与该基因相邻的均为SDF2L和PPM1F基因.两个CcIL-17Ns都有3个外显子,编码136个氨基酸,两者相似性高达为97.1％,CcIL-17Na、CcIL-17Nb和其他硬骨鱼类的IL-17N相似性分别为65.3％～97.1％、64.7％～96.3％,和鲤IL-17家族其他成员的相似性分别为32.9％～51.4％、31.4％～50.7％.鱼类IL-17家族系统树显示7个成员形成6支,其中1L-17A/F1和IL-17A/F3组成一支,其余6个成员单独成支,鲤IL-17N先与鲤科鱼类以94％置信值聚在一起,然后与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、大西洋鲑(Salmosalar)、青鳉(Oryzias latipes)、东方红鳍鲀(Takifugurubripes)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等以85％的置信值聚在一起,再与雀鳝(Lepisosteus oculatus)和腔棘鱼(Coelacanth)的IL-17N以95％置信值聚为一支.实时定量PCR结果显示CcIL-17Ns在受精后0.5 h和12 h的表达量极显著高于受精后25 h、35 h、60 h、120 h及仔鱼阶段的表达量(P＜0.01);CcIL-17Ns在鲤夏花和成鱼脑中的表达量均最高,显著(P＜0.05)或极显著(P＜0.01)高于其他组织.嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染导致CcIL-17Ns在各组织的表达均上调,感染6 h,脑中的表达量显著增加(P＜0.05),1 d,CcIL-17Ns在其他组织中均显著增加(P＜0.05),感染3d和7 d,表达量均下降至与对照组无显著差异(P＞0.05).构建原核重组表达载体pMAL-c2X-17N,在大肠杆菌(Escherichia coli)Transetta(DE3)中进行原核表达,使用镍柱纯化获得可溶的IL-17N 重组蛋白(MBP-17N).使用0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL 和100 ng/mL 的MBP-17N 孵育鲤肾组织8 h,结果显示,不同浓度的MBP-17N均使IL-lβ和NF-κB显著上调(P＜0.05);1 ng/mL和10 ng/mL的MBP-17N极显著上调IFN-y(P＜0.01);0.1 ng/mL、1 ng/mL 的MBP-17N 显著上调IL-6,1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL 的MBP-17N显著上调CCL20(P＜0.05);1 ng/mL的MBP-17N使TRAF6的表达显著高于对照组(P＜0.05).本研究通过分析鲤IL-17Ns的系统发育、测定该基因的时空表达特征,发现嗜水气单胞菌感染后各组织CcIL-17Ns表达上调、原核表达蛋白能引起炎症因子的表达,从而证实了鲤IL-17N参与炎症反应.